氧化苦參堿注射液對大鼠實驗性腦出血后作用的研究

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氧化苦參堿注射液對大鼠實驗性腦出血后作用的研究

王景祥1，姜微2，呂銘洋3， 張麗君4*

(1.吉林省柳河醫院,吉林 柳河135300;2.吉林大學中日聯誼醫院 超聲科，吉林 長春130033;

3.延邊大學基礎醫學院2013屆研究生，吉林 延吉133000；4.延邊大學附屬醫院 心內科，吉林 延吉133000)

氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(So-phora flavescensAi.t)等中提取的生物堿,分子式為C15H24N2O,具有四環的喹嗪啶類結構。研究發現,OMT延緩烏頭堿所致大鼠心律失常的發生[1]，對TLR4表達有抑制作用[2]。降低心肌細胞凋亡指數,抑制Fas蛋白表達,增強Bcl-2蛋白表達[3]。而對于腦出血方面的作用尚未見報道。本實驗通過模擬腦出血模型,探討氧化苦參堿注射液對腦出血后作用的研究。

1材料與方法

1.1　藥品及試劑

OMT分子量264.36,純度>98%,由天津一方科技有限公司提供。批號：AW7660；丹參注射液由正大青春寶藥業有限公司生產，批號030623。乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)試劑盒。由中生北控生物科技股份有限公司提供，批號：130461,120811.超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及NO試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。批號：20130821,20130819，20130911。

1.2　儀器

磷酸鋅水門汀,上海青浦尼康齒科器械廠生產;SN-2型腦立體定位儀,日本長城產;CJ型臺式牙鉆車上海產;JD-2000型電子天平,沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;SSW-420-2S型電熱三用水箱,上海博訊實業有限公司;101A-1 型干燥箱,上海市實驗儀器總廠。

1.3　動物

Wis tar 雄性大鼠50 只,體重240-250 g(吉林大學實驗動物部提供),按體重隨機分為5組,每組10只,即假手術組、模型組、陽性藥組( 丹參注射液1.5 ml/kg)、 氧化苦參堿注射液60 mg/kg、120 mg/kg劑量組。

1.4　方法

1.4.1建立大鼠實驗性腦出血模型用10%水合氯醛(350 mg/kg 體重)腹腔麻醉大鼠,大鼠俯臥位固定在腦立體定位儀上,固定門齒于門齒鉤上,將左右水平針分別穿破耳鼓膜并固定。將備皮后的大鼠頭部皮膚常規消毒,沿正中線切開,暴露顱骨、前囟和冠狀縫。找到前囟后,用鉆頭在顱骨表面鉆一直徑為1.0 mm圓孔,穿透顱骨但不傷及腦組織。將微量注射器取未肝素化的大鼠自體尾動脈血50 μl,垂直插入腦組織,位置為右側尾狀核。采用一次緩慢方法將50 μl動脈血緩慢注入尾狀核,注血速度約10 μl/min,注血時間約 5 min。用磷酸鋅水門汀封住鉆孔。局部涂抹青霉素粉,縫合皮膚,縫合尾部切口。局部碘酒消毒。注射用青霉素鈉6萬單位肌肉注射,連續用4天,預防感染。假手術組操作過程同上,但不向腦內注血。于術后12 h待大鼠清醒后進行Longa氏評分,每天腹腔注射(ip) 給藥 1次,給藥容積均為0.2 ml/100 g,假手術組給予相同體積的生理鹽水,連續給藥5 日。所有大鼠在術后第5天于Longa氏評分后在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下腹主動脈采血用于測定SOD、MDA及NO含量。取血離心測LDH及CK含量。

1.4.2神經癥狀觀察按Zea Longa的方法對大鼠的行為障礙進行分級評分,標準是:0分為未見神經障礙癥狀;1分為將大鼠尾巴提起,癱瘓側前肢曲收于腹下,不能完全伸展左側前爪;2分為除1級體征外,大鼠置于光滑平面上,推手術側肩部向對側移動時阻力降低;3分為除2級體征外,大鼠自由行走時向左側環轉、轉圈或傾倒;4分為大鼠出現軟癱,肢體無自由活動。

1.4.3腦含水量測定用10%水合氯醛深度麻醉大鼠，迅速取出全腦，用濾紙吸干腦表面液體和血跡，以注射點為中心，前后各1 mm冠狀面切取腦組織片厚2 mm，精確稱量濕重后放入電熱恒溫箱內80℃烘烤48 h,至恒重后稱取干重。按下列公式計算腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.4血漿SOD活性、MDA及NO含量的測定以10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈采血4 ml,0.2%肝素以1∶9 比例抗凝后1 000 r/min離心10 min,取血漿,按試劑盒要求操作,檢測SOD活性、MDA及NO含量。

1.4.5血清LDH及CK含量的測定取血離心，取大鼠血清用半自動生化分析儀按試劑盒說明書測定乳酸脫氫酶和肌酸激酶含量。

2結果

2.1　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠神經行為學評分影響

造模后5天，按ZeaLonga的方法對大鼠的行為障礙進行分級評分。與模型組比較,氧化苦參堿注射液各劑量組神經行為學評分明顯降低(P<0.05),結果見表1。

表1　　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠神經行為學的

與假手術組比較###P< 0.001;與模型組比較**P< 0.01

2.2　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠腦含水量(BWC) 的影響

大鼠腦出血后，模型組大鼠腦含水量明顯增加(P<0.05) ;氧化苦參堿注射液各劑量組腦含水量與模型組比較均明顯下降(P<0.05,P<0.01),結果見表2。

表2　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠腦含水量的

與假手術組比較##P< 0.01;與模型組比較*P< 0.05，**P< 0.01

2.3　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠血漿中 SOD、 MDA及NO含量的影響

各組大鼠血漿中 SOD、 MDA及NO含量見表3。與模型組比較,氧化苦參堿注射液30、60 mg.kg-1組，丹參注射液1.5 ml·kg-1組，SOD、MDA及NO含量明顯改變(P<0.05，P<0.01)。

±s，n=10)

與假手術組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05，**P< 0.01

2.4　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠血清中LDH、CK含量的影響

模型組大鼠術后血清中乳酸脫氫酶、肌酸激酶含量明顯增高,陽性組與氧化苦參堿注射液組均可顯著降低大鼠血清中乳酸脫氫酶、肌酸激酶含量(表4)。

表4　氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠血漿LDH

與假手術組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05，**P< 0.01

3討論

腦出血后顱內壓急劇增高,與迅速形成的顱內血腫共同作用,導致腦組織缺血、缺氧,甚至水腫、壞死,進而引起受損區域神經功能缺損,出現受損神經組織所支配側軀體肌張力減弱、癱瘓甚至死亡等行為障礙癥狀[4]。實驗動物腦出血后，于120 h進行行為學評分，根據觀察，在注射自體動脈血液后，大鼠迅速出現行為和功能異常，出現病變對側肢體不同程度的癱瘓，其功能異常程度與病變嚴重程度一致。 腦出血后血腫周圍神經細胞變性、水腫、壞死，導致神經功能喪失。因此,神經行為障礙癥狀常用作反映神經功能狀況的重要指標。

自由基具有很強的氧化性，具有強烈的引發脂質過氧化的作用，當腦出血機體組織缺血缺氧時，氧合作用降低，致SOD活性下降，損傷細胞膜，使細胞死亡。氧自由基被破壞，導致脂質過氧化反應，形成一系列的脂質過氧化物和降解產物丙二醛(MDA),MDA能與蛋白質及脂質交聯形成變性高分子聚合物而使其失去生理功能，當其堆積到一定程度和一定量，可破壞核內的DNA,RNA，使細胞萎縮死亡。因此SOD的含量直接地反映了腦出血后組織細胞抗自由基損傷的能力，而MDA的含量則間接地反映出腦出血后機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。NO合成過度時可產生神經毒性作用，促進白由基的產生、抑制酶活性及線粒體呼吸，造成細胞能量衰竭而死亡[4]。

腦出血血清中LDH、CK水平明顯升高,血清中LDH、CK水平的高低能一定程度上反映腦組織損傷的程度。而血清中LDH、CK水平常作為判斷腦細胞膜損傷程度的間接指標[5]。

本實驗表明氧化苦參堿注射液能夠減輕腦出血后血腫周圍組織損傷，從而降低腦水腫，改善腦出血后的各項行為學指標。通過氧化苦參堿注射液治療可顯著提高腦出血后大鼠血漿SOD活性,降低MDA、NO水平,降低大鼠血清LDH、CK水平，表明氧化苦參堿注射液對急性腦出血大鼠的上述治療作用與提高腦組織內內源性抗氧化酶活性、抑制組織過氧化等機制密切相關。

參考文獻：

[1]陳霞，李英驥，葛靜巖，等.氧化苦參堿對正常及烏頭堿誘發心律失常大鼠動作電位的影響[J].吉林大學學報(醫學版)，2004，30(5):704.

[2]李俐濤，張祥建，尹靜，等．氧化苦參堿對局灶性腦缺血大鼠腦組織炎癥信號TLR4表達的影響[J].中成藥，2009,31(2)：194.

[3]商蕾，王玲，孫宏麗，等．氧化苦參堿對大鼠急性心肌缺血時心肌細胞凋亡的影響[J].中國藥學雜志，2007,42(7)：501.

[4]李凌波，李晶，李紅，等．蒺藜皂苷對大鼠實驗性腦出血的腦保護作用[J].哈爾濱醫科大學學報，2006,40(2)：99.

[5]蔣冠南，申錦林，覃麗，等．冰黃液對大鼠急性腦出血作用的研究[J].中藥藥理與臨床2005，21(6)：74.

(收稿日期：2014-08-07)

文章編號：1007-4287(2015)05-0710-03

*通訊作者