miRNA在HPV相關腫瘤組織中的表達對比研究

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miRNA在HPV相關腫瘤組織中的表達對比研究

丁建龍1,吳文安2，孟凡旭3,鄧萍3*

(1.陜西省漢中市3201醫院 普外科，陜西 漢中723000；2.陜西省腫瘤醫院 放療科，陜西 西安710061；

3.吉林省腫瘤醫院 婦瘤放療科，吉林 長春130012)

人乳頭瘤病毒(HPV)通過表達病毒癌基因，干擾機體正常信號轉導、細胞因子活化及擾亂有效的細胞免疫應答形成了癌癥發病的確切因素，但此過程需要經歷長期且極其復雜的系列分子事件和多種編碼基因與非編碼基因的參與，并且在不同的感染部位，致癌的幾率和病理過程差異很大[1，2]；近年來,隨著微小RNA(miRNA)的基因表達調控網絡的逐漸發現，miRNA在腫瘤的發生、發展和轉歸過程的角色正成為基因調控領域的熱點；目前已經明確許多miRNA在腫瘤發生發展等病理過程有表達水平的變化，并參與到病毒感染性疾病中與病毒的感染、清除、復制等過程，但miRNA是否參與HPV感染細胞免疫逃逸調控以及發揮的作用尚無定論。本研究應用實時定量PCR技術檢測與HPV感染密切相關的宮頸癌、外陰癌和肛門癌中的miR21、miR29、miR31、miR101、miR143、miR126 、miR146和 miR155的表達量，并對比瘤體組織與癌旁正常組織中的表達差別，初步探討HPV病毒感染致癌病理過程中不同miRNA的表達變化。

1材料與方法

1.1一般資料隨機入組患者，簽署知情同意書，收集門診臨床診斷為CA的組織樣本，標本隨即存放于高壓滅菌的凍存管保存于液氮中。同時取洗體脫落細胞送檢進行HPV雜交分型鑒定。收集和填寫相關臨床資料,包括性別、年齡、發病部位、病程、初發/復發、復發次數和基礎疾病等信息。

1.2標本收集與處理①標本收集：收集本院婦外科、肛直腸外科2010年6月至2013年6月婦女子宮頸鱗癌30例、外陰鱗癌5例、肛門鱗癌2例；取樣前均未經放療、化療、免疫治療等治療手段干預。年齡33~63歲，平均(47.26±7.32)歲。

②miRNA提取：提取和擴增應用miRNA提取試劑盒(Takara公司)抽提各組組織中的總mRNA。各個miRNA的特異性引物購自Takara公司。PCR擴增采用熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)逆轉錄的反應體系為5 μl，反應條件為42℃ 60 min，70℃15 min， 4℃維持，將得到的5 μl cDNA加入20 μl熒光定量反應體系中，反應條件為預變性50℃ 2 min，95℃ 2 min，95 ℃15 s， 60 ℃30 s，72 ℃ 30 s； 40個PCR 循環，每次在延伸階段讀取吸光值，各樣本檢測重復3孔。以U6為內參照，利用其ΔCt值進行相對定量。即用同組中每個樣本目的基因的Ct值減去的U6的Ct值得到ΔCt,再用觀察組中目的基因的ΔCt減去對照組的△Ct得到ΔΔCt值，代入公式2-ΔΔCt計算即得到目的基因觀察組/對照組的值，以對照組目的基因的值為1，計算各實驗組miRNA的含量。

2結果

癌組織中miR15b、miR21、miR155表達量高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-145、miR34a、miR143、miR218表達量低于癌旁正常組，宮頸癌組miR145、miR218；外陰、肛門癌組miR143與癌旁組差異均有統計學意義(P<0.05)。miR146a僅在宮頸癌組顯示出了明顯的增高趨勢，而外陰、肛門癌組miR146a未見明顯的表達變化，且兩癌性組組間表現出明顯的差異(P<0.05)。miR218的表達明顯降低，尤其在宮頸癌組更為顯著，且宮頸癌組與外陰、肛門癌組組間表現出顯著的差異(P<0.05)。見表1。

3討論

HPV感染與宮頸癌、外陰癌、肛門癌的發生發展具有密切的關聯，宿主受到高危亞型HPV感染后，其會整合宿主染色體，通過癌蛋白影響抑癌蛋白的活性，使其失活從而引起癌癥的發生。但三種疾病的發病率有著巨大的差異，在發病率相對較高的宮頸癌患者中，也僅是由大約2%的HPV感染患者轉變而來；而外陰癌和肛門癌更為罕見。這異味著一些重要的扳機點在病毒致癌的病理過程中起到關鍵作用，而miRNA是重要的研究方向。

GroupmiR15bmiR21miR146amiR155miR145miR34amiR143miR218宮頸癌1.32±0.47*2.16±0.79*3.17±0.66*1.03±0.570.34±0.16*0.44±0.070.33±0.110.26±0.05*宮頸癌癌旁11111111外陰、肛門癌0.99±0.32*1.67±0.17*0.98±0.24△0.86±0.320.45±0.060.32±0.120.20±0.01*0.52±0.08△外陰、肛門癌癌旁11111111

*vs癌旁P<0.05,△vs宮頸癌P<0.05

目前關于HPV與miRNA之間的相關性還沒有統一的認識，本實驗的結果顯示，在宮頸癌、外陰、肛門癌癌組織中miR15b、miR21表達量高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，這意味著所檢測的具有原癌基因特性的微小RNA，可能在HPV感染致癌過程中發揮了作用；而值得注意的是，miR146a并沒有在外陰、肛門癌組織中表達增高，這意味著miR146a可能具有宮頸癌特異性，且與HPV感染相關性較弱。目前關于miR-146a在腫瘤發生發展中的作用尚存爭議，且miR-146a在不同類型腫瘤組織中的表達存在差異。研究表明子宮頸癌、Burkitts淋巴瘤等中其過表達，而miR-146a在前列腺癌等腫瘤組織中表達程下降趨勢[3-6]。目前認為miR-146a靶基因較為復雜，包括了p53等抑癌基因及kit癌基因等。本實驗結果標明其可能具有宮頸癌特異性，這可能由于miR-146a的靶基因是核因子κB依賴基因[7]。miR146a能否成為指示宮頸癌病理過程的特異性生物標志物，有待于進一步的深入探索。miR-21位于染色體脆弱區域，與HPV與宿主整合DNA的區域重合[8]，可能對腫瘤的發生有重要作用。

目前miR-145、miR34a、miR143、miR218均被認為是抑癌基因[9-11],但其與HPV感染的關系尚未明確。本實驗中，在宮頸癌、外陰、肛門癌癌組織中miR-145、miR34a、miR143、miR218表達量低于癌旁正常組織，其中宮頸癌組miR145、miR218；外陰、肛門癌組miR143與癌旁組差異均有統計學意義(P<0.05)，在HPV感染致癌過程中體現出了抑癌基因的功能。而miR218的表達明顯降低，尤其在宮頸癌組更為顯著，且宮頸癌組與外陰、肛門癌組間間表現出顯著的差異(P<0.05)，這可能和HPV亞型相關，可能是不同亞型病毒miRNA相互作用的結果。而miR34a、miR143在兩組癌組織中表達量并沒有顯示出差異，可能其與HPV感染關系較弱[12，13]。

目前的研究發現，HPV與宿主染色體的整合及相關miRNA在其中的調控作用的失衡，是細胞癌變過程的重要步驟。本文中三種疾病有著完全不同的發病過程及發病率，這也預示著癌癥的發生發展經歷了不同的分子機制及調控過程，而這一過程的深入探索，可能得到HPV致癌機理，并進一步讓獲取靶向性的癌癥的發生發展的分子阻遏位點成為可能，并可通過借助于表達差異對腫瘤及其分化轉歸情況進行診斷、預測，針對性的進行反義阻抑或表觀治療，或者成為腫瘤患者預后的評估指標。

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(收稿日期：2014-09-11)

文章編號：1007-4287(2015)05-0803-03

*通訊作者