穿心蓮內(nèi)酯對體外視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響

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穿心蓮內(nèi)酯對體外視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響

辛浩蓉1,閆東君2*,王旭飛1

(1.吉林省人民醫(yī)院 眼科， 吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長春130033)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)是嬰幼兒期最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤， 嚴(yán)重?fù)p害患兒的視力，并對生命健康產(chǎn)生威脅[1]。臨床工作中，常用的眼球摘除、外放射治療、化學(xué)治療對于患兒的心理和身體狀態(tài)的考驗(yàn)、損傷都是比較大的 。細(xì)胞增生增加是所有腫瘤失控性生長的主要分子生物學(xué)機(jī)制之一[2]，因此，探索抑制RB細(xì)胞增殖活性、毒副作用較小的藥物，對眼內(nèi)惡性腫瘤的治療具有重要意義。

近年來歷史悠久的中藥在多種抗腫瘤藥物中占據(jù)了較為突出的優(yōu)勢，沒有明顯的毒副作用是眾多化學(xué)治療藥物所不能及的。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide， AD)是傳統(tǒng)中草藥爵床科植物穿心蓮中提取出來的一類二萜類化合物,它通常作為一種消炎解毒藥物用于治療各種感染性疾病[3]。現(xiàn)代藥理活性研究表明，AD除了傳統(tǒng)的抗病毒作用外，也具有抗腫瘤的潛能[4，5]。目前，已經(jīng)有將穿心蓮內(nèi)酯作為有效成份的滴眼液用于眼部炎癥的臨床治療，但是穿心蓮內(nèi)酯對眼內(nèi)腫瘤RB有何影響，尚不清楚。本研究旨在觀察AD 對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 HXO-Rb44細(xì)胞的增殖和凋亡的何影響。

1材料與方法

1.1藥品和細(xì)胞株穿心蓮內(nèi)酯(純度>98%)購自Sigma- Aldrich 化學(xué)制品公司，用RPMI-1640培養(yǎng)液溶解，配制成 100 μg/ml的溶液濾過除菌保存?zhèn)溆谩Ｈ薘B細(xì)胞株HXO-Rb44，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所。

1.2主要試劑和儀器RPMI-1640(美國Hyclone公司)，類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司)，噻唑藍(lán) (美國Sigma公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(propidium iodine，PI)雙染試劑盒(美國Sigma公司)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，低溫細(xì)胞涂片離心機(jī)，流式細(xì)胞儀(美國Becton Dikinson公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤系 HXO-Rb44采用10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/ml，RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)基或進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，細(xì)胞懸浮狀態(tài)生長，選取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4噻唑藍(lán)比色法(MTT)測定細(xì)胞增殖收集對數(shù)生長期HXO-Rb44細(xì)胞，制備成密度為5×105/ml細(xì)胞懸液，接種到96孔板，80 μl/孔，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在96孔板中分別加入不同濃度的AD液20 μl/孔，使終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/ml， 另一組加入RPMI-1640培養(yǎng)液20 μl作為空白對照組。每個(gè)濃度加6個(gè)孔，共同置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，加入MTT液作用4 h，再加入酸化的10%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解12 h，采用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度(A)值，計(jì)算出穿心蓮內(nèi)酯對HXO-Rb44細(xì)胞的增殖抑制率及藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率收集對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成密度為5×105/ml，接種到100 ml培養(yǎng)瓶中，根據(jù)增長抑制率在50%以下的原則，選用IC50為30 μg/ml穿心蓮內(nèi)酯作為最佳實(shí)驗(yàn)藥物濃度，對照組采用RPMI-1640替代AD，37℃孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h后，離心收集，加入預(yù)冷的PBS洗滌。各取1 ml細(xì)胞， 依次加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，混勻，避光并在室溫下反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測，以隨機(jī)Cell Quest分析軟件結(jié)果計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2結(jié)果

2.1　穿心蓮內(nèi)酯對HXO-Rb44細(xì)胞增殖活性的影響

2.5-80.0μg/ml濃度范圍的AD對體外培養(yǎng)的HXO-Rb44細(xì)胞作用24h后，經(jīng)過MTT檢測，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，不同濃度AD實(shí)驗(yàn)組的A值分別與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。計(jì)算出HXO-Rb44細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖1)顯示AD對HXO-Rb44細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，并且隨著AD濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。AD對HXO-Rb44細(xì)胞的IC50為(16.003±0.015μg)/ml。

圖1　AD作用HXO-Rb44細(xì)胞后24h增殖抑制率

2.2　穿心蓮內(nèi)酯對HXO-Rb44細(xì)胞凋亡率的影響

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增長抑制率在50%以下的原則，選用IC50為30μg/ml穿心蓮內(nèi)酯作為最佳實(shí)驗(yàn)藥物濃度。16μg/mlAD分別作用HXO-Rb44細(xì)胞24h、48h后AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞的凋亡率的變化，正常活細(xì)胞AnnexinV及PI均低染(AnnexinV-PI- ) ,分布在流式細(xì)胞分析圖的左下區(qū)(LL) ；早期凋亡細(xì)胞AnnexinV高染而PI低染(AnnexinV+PI- ) ,分布在圖的右下區(qū)(RL)；晚期凋亡及死亡細(xì)胞AnnexinV及PI均高染(AnnexinV+PI+ ) ,分布在圖的右上區(qū)(RU)。將早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(RL)和晚期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(RU)之和稱為總凋亡率。結(jié)果(見圖2)顯示未經(jīng)藥物作用的對照組HXO-Rb44細(xì)胞的凋亡率僅為(1.61±0.09)%，AD作用24h后細(xì)胞凋亡率增加至(17.45±1.10)%，與對照組相比顯著升高(P<0.01)。隨著AD作用時(shí)間延長到48h，HXO-Rb44細(xì)胞的凋亡率逐步增加至(41.07±2.66)%。

A．正常對照組　B.AD作用24h組　C.AD作用48h組

3討論

在我國視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)病率居眼內(nèi)惡性腫瘤之首，最常見于嬰幼兒時(shí)期，患兒的早期就診率較低，早已經(jīng)不適宜保守治療，常常需要眼球摘除術(shù)、化學(xué)治療或外放射治療以挽救生命，這種破壞性較大的治療方法對患兒的心理和生存質(zhì)量都是巨大的考驗(yàn)。傳統(tǒng)的治療模式已經(jīng)無法滿足人們提高生存質(zhì)量的需求，價(jià)格昂貴的放化療同時(shí)帶來的各種嚴(yán)重副作用和抗藥性也限制了臨床應(yīng)用。因此，尋求新的治療渠道和治療藥物成了近來研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過體外觀察中藥穿心蓮內(nèi)酯對HXO-Rb44細(xì)胞的影響，為治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤尋求新的藥物。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,AD)是天然中藥植物穿心蓮的主要有效成分，為穿心蓮二萜內(nèi)酯類化合物主要成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、清熱解毒、消炎利膽等作用。近年來，隨著現(xiàn)代藥理研究的多樣化發(fā)展，穿心蓮內(nèi)酯在抗腫瘤方面具有良好的生物活性，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD可抑制HXO-Rb44細(xì)胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，表明AD有作為藥物治療RB的潛能。

MTT法是一種經(jīng)典的檢測細(xì)胞增生活性的方法，已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選，具有靈敏度高、 重復(fù)性好、 操作簡單的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中采用MTT法對AD抑制人HXO-Rb44細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了測定，并計(jì)算出2.5-80.0μg/mlAD對HXO-Rb44細(xì)胞的抑制率和IC50，發(fā)現(xiàn)AD能夠明顯的抑制HXO-Rb44細(xì)胞的增殖，治療效價(jià)較好，隨著藥物濃度的增加，抑制率也逐漸的增加，具有一定的劑量依賴性。此外，作為反應(yīng)藥物對腫瘤細(xì)胞敏感性的指標(biāo)IC50也提示AD對HXO-Rb44細(xì)胞的敏感性較高。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與諸多因素相關(guān)，如細(xì)胞增殖的增強(qiáng)、凋亡的抑制、新生血管形成等方面，增生與凋亡的平衡失調(diào)是腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性之一。因此我們檢測了AD作用后HXO-Rb44細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡，即程序性細(xì)胞死亡,在許多生理和病理調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用,其定性和定量檢測對于基礎(chǔ)和臨床用藥研究都有指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過AnnexinV/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測，AD作用24h后的HXO-Rb44細(xì)胞凋亡率從對照組1.61%增加至17.45%，隨著時(shí)間延長，細(xì)胞凋亡率繼續(xù)增加，呈現(xiàn)一定的時(shí)間效應(yīng)。

綜合上述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示AD能夠抑制HXO-Rb44細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為AD加入RB的綜合治療提供了一定的發(fā)展依據(jù)，但其具體的調(diào)控靶點(diǎn)和相關(guān)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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(收稿日期：2014-06-09)

文章編號：1007-4287(2015)05-0716-03

*通訊作者

基金項(xiàng)目:吉林省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2014ZC024)