高血壓患者體內脯氨酸寡肽酶酶學活性的臨床研究

曾　彥，王　東，許晶晶，張宇清

(中國醫學科學院·北京協和醫學院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫院 心內科，北京100037)

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高血壓患者體內脯氨酸寡肽酶酶學活性的臨床研究

曾彥，王東，許晶晶，張宇清*

(中國醫學科學院·北京協和醫學院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫院 心內科，北京100037)

摘要：目的檢測高血壓患者體內脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)酶學活性變化并探討這一變化與各臨床指標的相關性。方法選取2012年8月1日至2014年6月1日間就診于北京阜外心血管病醫院的高血壓1級患者45例、高血壓2級患者26例，高血壓3級患者24例及正常血壓受試者27例。所有參與者均行體格及超聲心動圖檢查，并抽取靜脈血以測定POP酶學活性以及相關生化指標。采用Pearson線性相關分析確定參數之間的變化及關系。結果與對照組相比，高血壓患者POP酶學活性減低(1級高血壓1.40±0.56 U、2級高血壓1.13±0.60 U、3級高血壓1.10±0.58 U，對比對照組1.82±0.47 U，均P<0.01)，與高血壓1級患者相比，高血壓2級和3級患者血漿中POP酶學活性減低(P<0.05)。Pearson線性相關分析提示POP酶學活性與收縮壓、舒張壓、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、左心室心肌質量指數相關(均P<0.05)。結論POP酶學活性隨著高血壓程度的加重而減低。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0739)

腎素血管緊張素系統在高血壓的發生發展中發揮著重要作用。脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)作為一種能水解血管緊張素(angiotensin,Ang)Ⅰ、Ⅱ的肽酶，可以將Ang I，Ang Ⅱ分子水解，生成Ang(1-7)[1]。Ang(1-7)是近年來發現的血管緊張素家族成員之一，具有擴張動脈血管、降低血壓、抗血管平滑肌細胞增殖等作用[2]。因此，POP活性的改變，可能會導致Ang(1-7)的生成減少，AngⅠ和AngⅡ蓄積增多，進而導致高血壓的發生發展。研究發現POP能降解多種神經肽、激素、細胞因子，如血管緊張素、P物質、促甲狀腺激素釋放激素、促性腺激素釋放激素等，提示其在血壓的調節以及精神障礙中起重要作用，而POP在腦中的濃度最高，引起了用其抑制劑治療認知和精神障礙的研究熱潮[3]。但國內外關于POP對高血壓發生發展的直接作用及其機制的相關報道較少，在高血壓患者中是否存在POP活性的改變值得研究和探討。本文通過檢測不同程度高血壓患者體內POP血清學活性，并與正常血壓人群進行比較，觀察其酶學活性的變化，探討這一變化與各臨床指標的相關性，為進一步的基礎醫學研究提供臨床依據。

1資料與方法

1.1研究對象選取2012年8月1日至2014年6月1日間就診于北京阜外心血管病醫院的高血壓病患者(高血壓組)和健康查體者(對照組)。高血壓組患者入選標準：①新發現高血壓且未曾服用任何抗高血壓藥物患者；②均符合《中國高血壓防治指南2010》(指南)[4]關于原發性高血壓的診斷標準；③男女不限，年齡35-70歲。高血壓患者排除標準：①不符合入選標準者；②合并有嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤等疾病者；③合并有器質性心臟病者；④合并有血糖不可控制的糖尿病者。高血壓組所有入選對象按照血壓的級別分為三個亞組：1級高血壓組 [收縮壓140-159 mm Hg和(或)舒張壓90-99 mm Hg]，2級高血壓組[收縮壓160-179 mm Hg和(或)舒張壓100-109 mm Hg]和3級高血壓組[收縮壓≥180 mm Hg和(或)舒張壓≥110 mm Hg]。

對照組入選標準：健康體檢人員，年齡35-70歲，均無高血壓病史和家族史，血壓均處于正常高值范圍內(收縮壓<140 mm Hg，舒張壓<90 mm Hg)，實驗室檢查、心電圖和超聲心動圖檢查均正常。對照組最終入選27例研究對象，男性15例，女性12例，平均(50.1±7.5)歲。

1.2　方法

對所有參與者進行體格檢查，測量身高、體重，并按照指南推薦的標準測量方法測量收縮壓和舒張壓。所有參與者均經隔夜禁食8-12 h，次日清晨抽取空腹肘靜脈自凝血7 ml，分裝兩個試管，其中4 ml送本院檢驗科測定空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)等指標，3 ml待其凝血后離心分離血清，于-80℃冰箱保存，用于測定POP活性。

采用GE vivid 7 彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為1-3 MHz。受檢者取左側臥位，平靜呼吸，同步連接Ⅱ導聯心電圖。應用經胸M 型超聲、二維超聲測量左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVED)、左心室室間隔(interventricular septal thickness,IVST)及后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)；據Devereux校正公式[5]計算左心室質量指數(left ventricular mass index,LVMI)；以M型超聲測量左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)；應用脈沖多普勒測量二尖瓣血流頻譜左室舒張早期(E)與舒張晚期的峰值流速(A)及比值(E/A)。

左心室質量(left ventricular mass，LVM，g)：LVM=O.8×{1.04×[(LVED+IVST+LVPWT)3-LVED3]}+0.6；

LVMI(g/m2)=LVM/體表面積，體表面積=0.0061×身高+0.0128×體重-0.1529)

采用熒光分析方法測定POP活性[6]，試劑盒由瑞士Bachem公司提供。每個反應體系包含10 μL血漿及90 μL緩沖液(50 mM Hepes，pH 7.5，250 mM NaCl；1 mM EDTA；1 mM DDT；150 μM Z-glycyl-prolyl-4-methylcoumarinyl-7-amide)，37°C孵育1 h。在340 nm紫外線激發下測定其熒光強度，來反應POP的酶學活性。

1.3　統計學分析

2結果

2.1　一般資料

三組間年齡和性別差異無統計學意義。與對照組相比，高血壓患者收縮壓、舒張壓、甘油三酯、總膽固醇、LDL-C升高，HDL-C減低，體重指數及空腹血糖差異無統計學意義，見表1。與對照組相比，高血壓患者POP酶學活性較低(P<0.01)，且與高血壓1級患者相比，高血壓2級和3級患者其血漿中POP酶學活性較低(P<0.05)，高血壓3級組的POP酶學活性雖較2級組低，但組間比較無明顯統計學差異(P>0.05)，見表1。

±s)

注：POP：脯氨酸寡肽酶；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇。與對照組相比，aP<0.01，cP<0.05；與1級高血壓組比較，bP<0.05。

2.2　各組超聲指標

對照組和高血壓患者IVST、LVPWT、LVMI、二尖瓣口舒張晚期A峰值及E/A差異均有統計學意義(P<0.01)；LVED及LVEF差異無統計學意義(P>0.05)。與1級高血壓組相比，2級和3級高血壓組IVST、LVPWT和LVMI增大，E/A減小，且有顯著性統計學差異(組間比較，均P<0.05)。高血壓3級組比2級組的IVST、LVPWT和LVMI增大，E/A減小，但組間比較無統計差異(組間比較，均P>0.05)，見表2。

±s)

注：IVST：左心室舒張末期室間隔厚度；LVPWT：左心室舒張末期左室后壁厚度；LVED：左心室舒張末期內徑；LVMI：左心室質量指數；LVEF：左心室射血分數；E：二尖瓣口舒張早期血流峰值速度；A：二尖瓣口舒張晚期血流峰值速度；E/A：E峰與A峰比值。與對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與1級高血壓組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.3　Pearson線性相關分析

Pearson線性相關分析提示POP酶學活性與收縮壓、舒張壓、甘油三酯、HDL-C、LVMI相關(P<0.05)，見表3。偏相關分析顯示，依次控制其他臨床指標，如年齡、體重指數、空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、LDL-C、HDL-C以及LVMI之后，POP酶仍與收縮壓和舒張壓相關(分別r=-0.238和-0.215，均P<0.05)。

表3　 POP酶學活性與臨床指標的Pearson相關性分析(n=122)

注：POP：脯氨酸寡肽酶；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LVMI：左心室質量指數。

3討論

本研究通過比較正常血壓人群和新發高血壓患者血中POP酶學活性，證實高血壓患者中，POP酶學活性隨著高血壓程度的加重而水平較低。線性分析顯示，控制其他臨床指標之后，POP酶仍與收縮壓、舒張壓相關。這些證據提示POP酶學活性的減低在高血壓發生發展中可能有重要作用。

腎素血管緊張素系統的過度激活是高血壓發生發展的一個重要機制，而POP可將Ang Ⅰ、Ang Ⅱ分子水解，生成Ang(1-7)[1,7]。POP酶是一種廣泛分布于組織中的絲氨酸內肽酶[8]，因不能降解大分子蛋白質被命名為脯氨酰寡肽酶。已知POP酶在腎皮質中特別豐富，但其最初發現于人類子宮，它有降解催產素的作用，該酶對AngⅠ、AngⅡ、緩激肽和加壓素等多肽有活性作用。另有研究顯示，在中樞神經系統中POP有影響學習和記憶的功能，這些發現也推動了幾種高親和力特異性抑制劑的研發[9]，例如，S-1709在大鼠體內(POP的一種高度特異的抑制劑)對POP的 Ki為1.3 nM，且對其他肽酶無抑制作用，包括氨肽酶M，二肽基肽Ⅳ，腦啡肽酶，內肽酶3.4.24.15和3.4.24.16，鈣蛋白酶和血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)。已有學者推測POP可能有調節血壓的作用[10]。有人曾建立了POP基因敲除小鼠模型，但并未報道這些小鼠的血壓值[11]。

另外，POP的催化產物Ang(1-7)是新近發現的Ang家族新成員，研究顯示，通過一氧化氮、前列腺素的介導，非降壓劑量的Ang(1-7)即可擴大緩激肽的擴血管效應[12]；Ang(1-7)可通過局部緩激肽的作用并依賴一氧化氮的機制實現中樞降壓作用[13]；Ang(1-7)還可以減少Ang Ⅱ引起的血管平滑肌細胞內鈣離子濃度的升高，并抑制血管平滑肌細胞增殖，進而影響血管和心臟的功能[14]。因此，Ang(1-7)具有擴張動脈血管、降低血壓、抗血管平滑肌細胞增殖等特點。POP作為生成Ang(1-7)的主要肽酶，其活性的高低直接影響到Ang(1-7)上述功能的發揮。因此，本團隊推測，體內POP酶學活性的減低可能會導致Ang(1-7)生成的不足，進而影響其功能的發揮，導致高血壓的發生和發展，而本研究中還發現血壓與POP酶活性呈負相關，更加證實了POP與高血壓發展之間的關系。

對于高血壓患者中為何存在POP酶學活性的偏低，尚未有明確的機制進行解釋。 Cumming等[15]發現，氧化應激狀態可以使POP分子內部形成二硫鍵,這使POP分子內的β螺旋片層區域的片層之間，及β螺旋片層區域和β水解酶區域之間不能協調地相對運動，導致POP的催化活性位點無法暴露給底物，喪失水解底物的能力，繼而表現為與這些底物有關的病理生理狀態改變，如血壓和心臟舒張功能的改變。本團隊認為，可能是由于高血壓患者體內存在炎癥及氧化應激等病理生理過程，POP分子在氧化應激條件下，內部二硫鍵形成，酶學活性降低。

最近的一項研究中，分別給野生型、C-KO(攜帶點突變的基因工程小鼠，其ACE的C-末端催化結構域可被特異性滅活)和N-KO(攜帶點突變的基因工程小鼠，其ACE的N-末端催化結構域可被特異性滅活)三組小鼠連續輸注AngⅡ兩周，顯示在第14天，C-KO組與野生組間的血壓值無顯著差異，而N-KO組的血壓則明顯高于其余兩組；隨后的研究中，用POP抑制劑(S-17092)對N-KO和野生型小鼠均進行預處理后，再予等劑量的AngⅡ，發現經S-17092預處理的N-KO小鼠的血壓值與野生組持平，低于未經S-17092預處理的N-KO小鼠組；該研究還發現盡管N-KO組的血清AcSDKP(AcSDKP是一種小分子肽，由POP酶水解產生，該過程可以被S-17092抑制)水平明顯升高，但它并不是引起N-KO小鼠血壓升高的原因[16]。上述結果說明，在控制血壓過程中，POP酶和ACE的作用間可能存在一個重要平衡，但POP抑制劑的具體降壓作用機制并不清楚，認為可能有其它POP產物也與ACE的N-末端相互作用。雖然該試驗結果與本研究結果相互矛盾，實質上均說明POP有影響血壓的作用，但是由于其作用過程復雜，可能涉及到多路徑、需多種因子的參與，其中任一環節發生改變都將不同程度地影響血壓，故其結果究竟是升壓作用還是降壓作用，還需根據具體的路徑加以分析。另有兩項關于脯氨酰羧基肽酶(prolylcarboxypeptidase，PRCP)的研究。PRCP又稱血管肽酶C，其作用機制是通過代謝AngⅡ、AngⅢ分別生成Ang1-7 和Ang2-7[17]，具有與POP類似的作用過程。研究發現，氯沙坦能有效降低大鼠血壓和逆轉腸系膜動脈肥厚，其作用機制可能與PRCP的表達上調有關[18]。在氯沙坦對兩腎一夾高血壓大鼠的研究中發現，氯沙坦能顯著升高非手術側腎臟組織中PRCP、血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶的蛋白表達，降低TGF-β1蛋白的表達，認為這一作用可能與其增強大鼠體內PRCP-血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶調節軸功能、降低TGF-β1蛋白的表達有關[19]。綜合以上研究結果，目前，POP調控血壓的具體路徑尚不明確，需進一步的基礎和臨床試驗加以論證。

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關鍵詞：高血壓；脯氨酸寡肽酶；血管緊張素；超聲心動圖

Evaluation of prolyl oligopeptidase enzymatic activity in hypertensive patientsZENGYan,WANGDong,XUJing-jing,etal.(CardiologyDepartment，FuwaiHospital，NationalCenterforCardiovascularDiseases，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100037，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the enzymatic activity of prolyl oligopeptidase (POP) in hypertensive patients and explore the relations between the changes of POP enzymatic activity and clinical features.MethodsForty-five patients with grade 1 hypertension,26 patients with grade 2 hypertension，24 patients with grade 3 hypertension and 27 normotensives were included in the present study,who were selected from Fuwai Hospital from 1st August,2012 to 1st June,2014.All the participants underwent physical and echocardiographic examinations.Meanwhile,fasting blood was collected to determine the POP enzymatic activity and routine biochemical indicators.ResultsCompared with the controls,POP enzymatic activities were significantly reduced in hypertensive patients (grade 1 hypertention 1.40±0.56 U，grade 2 hypertention 1.13±0.60 U，grade 3 hypertention 1.10±0.58 U vs the controls 1.82±0.47 U，allP<0.01),and this reduction was more evident in patients with grade 2 or 3 hypertention as compared to ones with grade 1 hypertention(P<0.05).Pearson correlation analysis showed that POP enzymatic activity was significantly associated with systolic blood pressure,diastolic blood pressure,triglyceride,high density lipoproteins and left ventricular mass index(P<0.05).ConclusionPOP enzymatic activity was reduced with the increasing blood pressure.

Key words:Hypertension;Prolyl oligopeptidase;Angiotensin;Echocardiography

(收稿日期：2014-10-05)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R544.1

文章編號：1007-4287(2015)05-0739-05

*通訊作者