首例同時攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的ST11肺炎克雷伯菌臨床株

油麗萍，陳愛文，秦　萍，徐　茶，趙　輝，吳春梅，朱元祺*

(1．青島大學醫學院，山東 青島266071；2.青島大學附屬醫院，山東 青島266003)

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首例同時攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的ST11肺炎克雷伯菌臨床株

油麗萍1，陳愛文2，秦萍2，徐茶1，趙輝1，吳春梅1，朱元祺2*

(1．青島大學醫學院，山東 青島266071；2.青島大學附屬醫院，山東 青島266003)

摘要：目的探討產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐藥機制，為醫院感染控制提供依據。方法法國VITEK-2 Compact對細菌進行鑒定和藥敏試驗；改良Hodge試驗初篩肺炎克雷伯菌是否產碳青霉烯酶；多重PCR對菌株進行β-內酰胺類耐藥基因和16S rRNA甲基化酶基因的檢測，測序確認基因型；多位點序列分型和脈沖場凝膠電泳實驗進行細菌的同源性分析。結果5株肺炎克雷伯菌多位點序列分型是ST11型，其中4株都同時攜帶有blaspan、blaspan、blaspan和16S rRNA甲基化酶rmtB基因，另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同時攜帶blaspan、blaspan、blaspan、blaspan和blaspan基因。脈沖場凝膠電泳顯示，除了HD04菌株多一條帶外，其余帶型5株菌完全一致。結論經檢索，肺炎克雷伯菌同時攜帶blaspan、blaspan、blaspan、blaspan和blaspan基因為國內外首次報道，且該感染者無國外流行病學史。因此，要進一步加強對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌的醫院感染控制和預防。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0744)

碳青霉烯類抗生素被認為是目前臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的最后的一道防線。隨著這類抗菌素使用的增加，臨床上對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的分離率也不斷上升。在國內外，由產KPC酶和/或金屬酶的腸桿菌科細菌造成的感染，甚至暴發流行，也均有報道[1-3]。尤其是產NDM-1金屬酶的“超級細菌”的出現，對臨床治療，控制醫院感染的流行和爆發，都將面臨更嚴峻的挑戰。因此，本研究是對2013年1-12月收集的碳青霉烯類耐藥的5株肺炎克雷伯菌臨床株的耐藥表型、耐藥基因和同源性進行檢測分析，以便為醫院感染控制提供依據，現報道如下。

1材料與方法

1.1菌株的來源5株菌為2013年1月至2013年12月從臨床標本中篩選出的對碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌。采用VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統對細菌進行鑒定和藥敏，判定耐藥性標準依據CLSI2013(美國臨床實驗室標準化研究所制定)進行，并以Escherichia coli ATCC25922，Escherichia coli ATCC35218和 Klebsiella pneumoniae ATCC700603作為質控菌株。

1.2儀器和試劑法國VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統；北京天根生化科技有限公司的離心柱型，基因組提取試劑盒和電泳級瓊脂糖；大連寶生的PCR試劑盒和核酸分子量標準；英國Oxoid公司的Mueller-Hinton培養基、美國Bio-Rad的PCR擴增儀和脈沖場電泳，以及全自動凝膠成像系統(Alpha Innotech)。

1.3耐藥基因的檢測按試劑盒說明書操作進行基因組提取。耐藥基因的PCR擴增：(1)金屬酶和非金屬酶耐藥基因：KPC、BIC、OXA48、NDM、IMP、VIM、SPM、AIM、GIM、SIM、DIM)；(2)超廣譜β-內酰胺酶基因：SHV、TEM、OXA1、CTX-M分群；(3)AmpC基因：MOX、CIT、DHA、ACC、EBC；(4)16S rRNA甲基化酶基因。擴增目的基因的引物及實驗條件參照文獻[4-8]進行。引物合成，陽性擴增產物測序，均由上海生工公司完成。獲得序列與GenBank中序列進行比對，以確定基因型。

1.4多位點序列分型((multilocus sequence typing，MLST)和脈沖場凝膠電泳(PFGE)依據MLST網站，設計7對管家基因的引物，PCR條件見網站。擴增產物送上海生工進行測序，序列結果在MLST網站上進行比對，以得到細菌的一個序列型。脈沖場凝膠電泳進行同源性分析的操作參照相關文獻。電泳條件：設片段為10-400 kb，場強6 v，轉角120，電泳時間18 h。

2結果

2.1　菌株對常用抗生素的耐藥性和耐藥基因的檢測

分離的5株肺炎克雷伯菌對臨床常用的抗生素都耐藥，改良Hodge試驗也均為陽性。基因檢測顯示：5株菌中4株都同時攜帶有blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTXG9和16S rRNA甲基化酶rmtB基因，另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同時攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因。結果詳見表1和圖1。

表1　產碳青霉烯酶肺炎克雷白桿菌分離株對常用抗生素耐藥性和攜帶的基因

M：DNA標準分子量；1-5：HD01-05株blaKPC陽性；3：HD03株blaNDM陽性

圖1blaKPC和blaNDM基因多重PCR擴增產物電泳圖

2.2　菌株的同源性分析

5株肺炎克雷伯菌多位點序列分型都是ST11型。脈沖場凝膠電泳顯示，除了HD04菌株多一條帶外，5株菌其余帶型幾乎完全一致。結果詳見圖2。

M：DNA標準分子量；1-5：HD01-HD05肺炎克雷伯菌臨床分離株

3討論

自2001年美國報道KPC酶后，世界各地均見報道，其中美國和希臘有顯著的地方性流行。2007年，Wei等首次報道[9]在國內浙江地區發現了產KPC-2酶的肺炎克雷伯菌，此后在全國各地陸續報道檢出KPC-2陽性菌株。2009年，印度首次報道發現產NDM-1酶的肺炎克雷伯菌。此后，世界多個國家和地區報道分離到產NDM-1酶的細菌。該酶可水解包括碳青霉烯類在內的幾乎所有廣譜β內酰胺類抗生素，并可同時攜帶多種其他耐藥基因，給臨床治療和醫院感染控制帶來巨大挑戰。國內感染攜帶產NDM-1酶基因細菌的病例數逐年增多，多為腸桿菌科細菌，且多屬散發，在浙江杭州、北京、上海、蘭州、江西和廣州等地均有報道。

多位點序列分型(sequence type，ST)是常用的分子流行病學研究方法。巴士德研究院2005年命名的ST11與2008年命名的ST258只有一個管家基因(tonB)的差別，屬于同一個克隆復合體CC258，兩者有比較近的親緣關系。研究表明，ST258型是歐美國家肺炎克雷伯菌KPC的主要流行株，中國則以ST11型為主。我們的結果表明，5株肺炎克雷伯菌都是ST11型，與國內報道關于肺炎克雷白桿菌攜帶blaKPC-2基因的ST分型結果相似。但是，對于產NDM-1酶的肺炎克雷伯菌，國內外還沒有主要的ST型流行株的相關報道。

分離的5株菌改良Hodge試驗均為陽性，且對常用的抗生素都耐藥。基因檢測顯示， 4株都同時攜帶有blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTXG9和rmtB基因，但另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同時攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因。經檢索，肺炎克雷伯菌同時攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因是國內外首次報道。對該菌攜帶質粒的數目、大小、接合和轉移實驗以及基因周圍環境的分析正在進行。另外，脈沖場凝膠電泳顯示，除HD04菌株多一條帶外，5株菌其余帶型完全一致，根據Tenover制定的規則，提示醫院存在攜帶blaKPC-2肺炎克雷伯菌克隆株的流行。

綜上所述，本地肺炎克雷伯菌臨床株對碳青霉烯類抗生素的耐藥與其攜帶ESBLs基因、AmpC基因、碳青霉烯酶基因、以及其他耐藥基因的同時存在有關。提示我們，要加強耐藥菌的監測，采取消毒隔離措施，防止CRE在醫院的擴散和傳播。

參考文獻：

[1]Centers for Disease Control and Prevention (CDC).Notes from the field: hospital outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae producing New Delhi metallo-beta-lactamase-Denver,Colorado,2012[J].Morb Mortal Wkly Rep,2013,62(6):108.

[2]李靜,胡志東.產碳青酶烯酶肺炎克雷伯菌的檢測與分析[J].中華醫院感染學雜志,2010,20(15):2324.

[3]Zhao JY,Zhu,YQ,Li YN,et al.Coexistence of SFO-1 and NDM-1 β-lactamase genes and fosfomycin resistance gene fosA3 in an Escherichia coli clinical isolate [J].FEMS Microbiology Letters,2015,362:1.

[4]Poirel L,Walsh TR,Cuvillier V,et al.Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,70:119.

[5]Woodford N,Fagan EJ,Ellington MJ.Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding CTX-M extended-spectrum β-lactamases[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy ,2005,57:154.

[6]Colom K,Pérez J,Alonso R,et al.Simple and reliable multiplex PCR assay for detection ofblaTEM,blaSHVandblaOXA-1inEnterobacteriaceae[J].FEMS Microbiol Lett,2003,223:147.

[7]Pérez-Pérez FJ,Hanson ND.Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40:2153.

[8]Ber?ot B,Poirel L,Nordmann P.Updated multiplex polymerase chain reaction for detection of 16S rRNA methylases:high prevalence among NDM-1 producers[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2011,71:442.

[9]Wei ZQ,Du XX,Yu YS.Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumonia isolate from china[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(2):763.

關鍵詞：肺炎克雷伯菌；基因；blaNDM-1；blaKPC-2；ST11

Coexistence ofblaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1andblaOXA-1genes in a clinical ST11Klebsiellapneumoniaeisolate in chinaYOULi-ping,CHENAi-wen,QINPing,etal.(TheMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the molecular mechanism of the clinical carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolates.MethodsThe strains identification and antibiotic susceptibilities were performed by VITEK-2 compact system.The genes of AmpC，ESBLs，MBL and KPC β-lactamases were screened by specific PCR.And genotypes were confirmed by DNA sequencing.PFGE and multilocus sequence typing (MLST) were performed.Results5Klebsiellapneumoniaeisolates were resistant to all antibiotics tested.Genotyping(PFGE) clustered 5K.pneumoniaeisolates into a single clonal type and MLST assigned them to sequence type 11.Theblaspan，baspan，blaspanand rmtB genes were present in four isolates.And Molecular testing verified the presence ofblaspan，blaspan，blaspan，blaspanandblaspangenes in aKlebsiellapneumoniaeisolate.ConclusionTo our knowledge,this is first report of coexistence ofblaspan，blaspan，blaspan，blaspanandblaspangenes in a clinicalKlebsiellapneumoniaisolate.It may herald the emergence of a new pattern of drug resistance.Surveillance of metallo-β-lactamases inenterobacteriaceaeis urgently needed to control and prevent the spread of these isolates.

Key words:Klebsiellapneumonia;Gene;blaNDM-1;blaKPC-2;ST11

(收稿日期：2014-05-07)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R378

文章編號：1007-4287(2015)05-0744-04

*通訊作者

基金項目：青島經濟技術開發區重點科技發展項目(2013-1-82)