Fibulin-5在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中的表達及意義**

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Fibulin-5在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中的表達及意義**

程曉燕吳紅蓮呂偉超朱衛中鄭紅楓

浙江省麗水市人民醫院婦科323000

盆腔臟器脫垂是婦科的常見病，多發于中老年婦女，雖然其對患者的生命無威脅，但是嚴重影響其生活質量。盆腔臟器脫垂的主要治療方法為手術治療，是絕經后婦女行婦科手術的常見原因[1]。但該類手術復發率較高，近30%患者因術后復發需再行手術。關于盆腔臟器脫垂的相關研究幾十年，至今其發病機制尚不完全清楚，考慮為多因素的作用。其中盆底支持組織中結締組織與其密切相關，結締組織的彈性、韌性以及相關功能均影響著盆腔臟器脫垂的發生。彈性纖維的缺失促進了結締組織的老化。彈性蛋白是構成細胞外基質的主要成分，一般是以彈性蛋白原的形式分泌至細胞外，通過彼此交聯進而形成彈性纖維[2]。在彈性蛋白聚合過程中, Fibulin-5作為彈性蛋白交聯排列的支架使LOXL-1集中在纖維集合位點從而生成彈性蛋白共價交聯。本文通過測定盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中Fibulin-5的表達情況，探討Fibulin-5與其發生發展的相關性，具體如下。

1臨床資料

選擇2012年12月-2014年12月我院絕經后因盆腔器官脫垂需行全子宮切除患者50例為實驗組，選擇同期絕經后無盆腔器官脫垂因其他婦科疾病(如子宮良性腫瘤或子宮頸上皮內瘤變等婦科疾病)需行全子宮切除患者50例為對照組。分別于術中取子宮主韌帶長度約0.5cm。

2研究方法

2.1實時定量RT-PCR檢測Fibulin-5 mRNA

2.1.1標本準備：所有組織均在行全子宮切除術中留取,取距宮頸0.5cm處子宮骶韌帶,長度約0.5cm,離體30min內無菌條件下立即至于-80℃冰箱或液氮中保存備用。

2.1.2總RNA提取和逆轉錄：取上述備用主韌帶組織，研磨成漿狀，加入1ml Trizol勻漿，于室溫下放置5min。將漿狀組織移至EP管中，加入氯仿并離心，將EP管中上層水相移至新的EP管中。后加入0.5ml異丙醇，室溫沉淀離心,棄上清。加乙醇1ml洗滌RNA。所得RNA溶于DEPC水中,取5μl經2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性。其余RNA于-20℃保存。

25μl反轉錄體系中包括總RNA 4μg(約2μl),M-MLV(美國Promega公司) 1μl,5X緩沖液5μl,dNTP 2μl,RNasin 0.5μl,隨機引物1μl,25mmol/L MgCl24μl及DEPC水。反轉錄條件:42℃ 60min,95℃ 5min,冰浴5min,此反應產物即為反轉錄的cDNA,置-20℃保存。

2.1.3實時定量PCR檢測Fibulin-5 mRNA水平：采用RT-PCR法檢測Fibulin-5的表達。采用逆轉錄酶和通用引物oligo(dT)15，以RNA為模板經逆轉錄反應合成cDNA第一鏈。再以cDNA為模板，用內標引物與目標引物進行特異的PCR擴增。PCR反應條件為：50℃ 180s、95℃ 300s，然后95℃15s、60℃ 45s，共40個循環。計算HEC1的表達量=2-ΔCt×100%，ΔCt= Ct目標基因值-CtGAPDH[3]。引物序列見表1。

表1　基因的引物和探針序列

2.2ELISA檢測Fibulin-5的表達取上述備用主韌帶組織，研磨成漿狀，于室溫下放置5min,將漿狀組織移至EP管中離心，去上清液備用。采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法檢測所有受檢者Fibulin-5水平，試劑盒購自武漢優爾生科技股份有限公司，按照Fibulin-5試劑盒說明書中操作流程進行操作。

2.3統計學分析采用SPSS13.0統計軟件進行處理，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗及單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1兩組子宮主韌帶中Fibulin-5 mRNA表達水平比較經過統計學分析，結果顯示觀察組患者的主韌帶組織中Fibulin-5 mRNA的表達為0.36±0.12，對照組為0.92±0.34，觀察組Fibulin-5的表達明顯低于對照組，差異顯著(P<0.05)。

3.2兩組患者Fibulin-5蛋白表達水平比較Fibulin-5蛋白表達在兩組之間的變化與Fibulin-5 mRNA的變化趨勢較為一致,觀察組患者血清Fibulin-5水平為(44.8±12.0)μg/L，對照組為(110.2±40.2)μg/L，觀察組Fibulin-5水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

4討論

4.1盆腔器官脫垂的發病機制盆底功能障礙性疾病是絕經后婦女的常見病、多發病，主要病理改變為組織結構和功能的缺陷，嚴重影響患者的生活質量。關于盆腔臟器的研究諸多，多認為其致病是多因素作用于盆腔臟器結締組織，導致結締組織發生質和量上的改變，從而不能發揮支持的作用，引起盆腔臟器脫垂。早在1990年就有學者提出了“盆底整體”的理論，將盆底的結締組織針對性地分為上中下三個水平：上段為主骸韌帶復合體；中段主要是陰道的側方支持，盆腔筋膜鍵弓及陰道直腸筋膜；下段為陰道的遠端支持，包括會陰體和會陰隔膜。此三個水平結締組織的任何一方發生結構改變及功能障礙，都可能導致盆腔器官脫垂的發生[3]。

細胞外基質主要包括膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖以及糖蛋白，是盆底支持組織的重要組成部分之一。任何一種成分的結構或含量的變化，都可能降低盆底組織彈性，降低其抗張能力，削弱細胞外基質對盆底的支持作用，進而引起盆腔臟器脫垂。細胞外基質的多種成分中，彈性蛋白是重要成分之一，其主要由彈性軟骨細胞、平滑肌細胞以及成纖維細胞分泌。彈性蛋白是以彈性蛋白原的形式被分泌，在細胞外靠近質膜處發生交聯，形成疏松的富于彈性的網狀結構，即彈性纖維。彈性蛋白需要交聯形成彈性纖維后，才能發揮其相應的功能[4]。彈性蛋白構成彈性纖維的中心，在蛋白外圍由微纖維原包繞，可以調節彈性蛋白分子組裝成彈性纖維。彈性纖維大量存在于女性生殖器官，一般狀態下其代謝緩慢，而在妊娠期以及分娩后會大量重塑。一旦妊娠期或分娩時，生殖道組織彈性纖維降解之后不能很好重塑，就易破壞彈性纖維的結構，不能發揮支持的作用，引起生殖道組織結構功能的缺陷。彈性纖維的良好功能，在產后盆腔臟器的復舊中意義重大。

4.2Fibulin-5的結構與特性Fibulin家族是一個細胞外基質蛋白家族，有證據表明，Fibulins家族是蛋白質中的一個古老家族。早在原蟲時期，就存在Fibulin家族，直到人類物種的形成，Fibulin家族一直高度保守。Fibulin家族主要包括兩個亞群，第一個亞群主要有Fibulin-1、Fibulin-2以及Fibulin-6，第二個亞群主要有Fibulin-3、Fibulin-4、Fibulin-5以及Fibulin-7，其中第二個亞群因蛋白鏈較短，又稱短小Fibulin。

Fibulin-5是細胞外基質的糖蛋白，共有448個氨基酸，位于14q32，在機體富含彈性蛋白的組織中廣泛分布[5]。Fibulin-5的C末端含有6個cb EGF-like區域，在細胞外與鈣離子結合，介導內皮細胞吸附，并結合細胞表面的整合素等，進而與原彈性蛋白結合，將原彈性蛋白整合到細胞表面，促進彈性纖維的形成。Fibulin-5促使原彈性蛋白附著并定向排列于細胞表面，通過類賴氨酞氧化酶-1 (LOXL-1)的催化，氧化脫氨基作用使得彈性蛋白中賴氨酸或輕賴氨酸氧化成醛基賴氨酸，而后合成高度穩定的共價交聯結構，促進彈性纖維的組裝。因此，在彈性蛋白聚合過程中，Fibulin-5作為彈性蛋白交聯排列支架使LOXL-1集中在纖維集合位點從而生成彈性蛋白共價交聯。正是因為彈性蛋白中富含此種交聯，各個原彈性蛋白分子間的相對位置較為穩固，給予外力時雖可暫時移位，一旦去除外力，即回復到原來構型，成為彈性纖維富于彈性的結構基礎[6]。

4.3Fibulin-5與盆腔器官脫垂的相關性盆腔臟器的支持主要依靠盆底結締組織，其中彈性纖維發揮重要作用。彈性纖維在女性生殖器官中含量豐富，具有較強的膨脹及伸展能力。一般情況下，妊娠三個月的胎兒即產生彈性纖維。有學者研究小鼠真皮時發現，小鼠出生時高表達Fibulin-5、彈性蛋白原等，隨后逐漸減少至一個較少的水平。在成人組織中正常生理條件下，彈性纖維的代謝較緩慢，在整個生命周期都是比較穩定地存在[7]。正常絕經后婦女的子宮主韌帶組織中彈性纖維是完整沒有損傷的，而盆腔器官脫垂患者的彈性蛋白受損甚至缺失，考慮盆腔器官脫垂患者在產后彈性蛋白合成減少，進而削弱了盆底結締組織的彈性機能，進而促進了盆腔器官脫垂的發生[4]。有研究Fibulin-5基因缺失的小鼠全身的彈性纖維均嚴重異常，部分小鼠能成活到成年，但其大動脈缺乏順應性，且皮膚松弛并患有嚴重肺氣腫，進一步研究斷裂的彈性蛋白片段，提示彈性蛋白酶活性未發生改變即彈性纖維分解未增加，而是彈性纖維合成缺陷。Fibulin-5是彈性纖維組裝過程中的重要結合蛋白，能促進原彈性蛋白的交聯，進而形成彈性纖維[8]。上文中所說的Fibulin-5基因缺失的小鼠有類似于盆腔臟器脫垂的表現，即說明在盆腔支持組織功能中彈性纖維的合成與組裝是關鍵。彈性纖維動態平衡的破壞，可能直接導致盆腔臟器脫垂的發生。

本文通過比較盆腔器官脫垂患者與無盆底功能障礙性疾病的患者主韌帶組織中的Fibulin-5的表達，發現在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中Fibulin-5的表達量明顯降低，進一步證實了Fibulin-5表達的降低可導致彈性蛋白合成障礙，無法形成穩定的彈性纖維或彈性纖維合成減少,盆底支持組織中細胞外基質彈性能力下降，導致盆腔器官脫垂的發生，說明Fibulin-5與盆腔臟器脫垂發病的相關性。

參考文獻

[1]張曉霞，費軍偉，徐紅梅，等.老年女性婦科住院患者368例臨床分析〔J〕.中國婦幼保健，2006,21(17):2349-2351.

[2]陳遠群，任慕蘭.盆腔器官脫垂發病機制的研究進展〔J〕.中國婦幼健康研究,2008,19(5):507-509.

[3]曹霽雯.ELASTIN變異與盆腔器官脫垂〔D〕.石家莊：河北醫科大學,2010.

[4]張晶,黃向華,張琳, 等.盆腔器官脫垂患者盆底結締組織中Fibulin-5和LOXL1的表達及意義〔J〕.實用婦產科雜志,2013,29(6):437-440.

[5]王睿,楊欣.Fibulin-3與Fibulin-5在盆腔器官脫垂發病機制中的研究進展〔J〕.現代婦產科進展,2010,19(11):857-859.

[6]鄭燃,李博,歐陽玲，等.Fibulins與盆腔器官脫垂的研究〔J〕.吉林醫學,2012,33(8):1656-1659.

[7]鄧秀英，葉明，范雪梅,等.女性盆底障礙性疾病盆底支持組織中基質金屬蛋白酶活性分析〔J〕.廣州醫藥,2007，38(3):1-3.

[8]李博，張清富，林雪燕，等.盆腔器官脫垂患者陰道前壁組織中彈性蛋白和細胞外基質蛋白 Fibulin-5 的表達及意義〔J〕.中華婦產科雜志，2009,44(7):514-517.

(編輯雅文)

摘要目的：研究Fibulin-5在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中的表達，分析其與盆腔器官脫垂程度之間的相關性。方法：選取我院婦科行子宮全切術的患者100例作為研究對象，根據手術病因不同分為觀察組和對照組，其中觀察組患者病因為盆腔器官脫垂，對照組病因為無盆底功能障礙性疾病的婦科疾病，收集所選患者的主韌帶組織，采用實時定量PCR以及酶聯免疫吸附法測定Fibulin-5的表達，比較兩組患者Fibulin-5的表達情況并分析。結果：經過統計學分析，顯示觀察組患者的主韌帶組織中Fibulin-5 mRNA的表達明顯低于對照組，血清Fibulin-5水平亦明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：患者主韌帶組織中Fibulin-5表達的降低，可導致彈性蛋白合成障礙，無法形成穩定的彈性纖維或彈性纖維合成減少,盆底支持組織中細胞外基質彈性能力下降，與盆腔臟器脫垂發病有關。

關鍵詞Fibulin-5盆腔器官脫垂主韌帶組織

Expression of Fibulin-5 in Main Ligament of Pelvic Organ Prolapse

CHENG Xiaoyan,WU Honglian,LV Weichao,etal.LishuiPeople’sHospital,ZhejiangProvince323000

ABSTRACTObjective:To study the Fibulin-5 main ligament tissue of the patients with pelvic organ prolapse, analysis with the relationship between the degree of pelvic organ prolapse.Methods:Select our hospital department of gynaecology line of 100 patients with uterine full cut method as the research object,according to different operation causes are divided into observation group and control group,the observation group of patients disease because of pelvic organ prolapse, control group disease because of non pelvic floor functional disorder disease of department of gynaecology,collect the selected patients with main ligament tissue,using real-time quantitative PCR and enzyme linked immunosorbent assay Fibulin-5 expression, compared two groups of patients Fibulin-5 expression and analysis.Results:The results of after statistical analysis,according to observation group of patients with primary Fibulin-5 mRNA expression in ligament tissue significantly lower than the control group, the serum levels of Fibulin-5 is significantly lower than the control group, there were significant difference of statistically significant (P<0.05).Conclusion:The patients with primary Fibulin-5 expression in the tissues of the ligament is reduced,which can lead to elastic protein synthesis disorder, unable to form stable elastic fiber or synthetic elastic fibers decrease,flexibility of extracellular matrix in the supportive tissue of the pelvic floor ability to drop, associated with the onset of pelvic organ prolapse.

KEY WORDSFibulin-5,Pelvic organ prolapse,The main ligament tissue

收稿日期2015-06-19

中圖分類號：R711.2

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)21-2898-03

基金項目：2012年浙江省麗水市科技局課題(2012ZC040)