臍帶間充質干細胞移植治療大鼠膠原誘導關節炎模型的療效觀察

趙　成, 張　璐, 王　紅, 劉布駿

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 風濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

臍帶間充質干細胞移植治療大鼠膠原誘導關節炎模型的療效觀察

趙成, 張璐, 王紅, 劉布駿

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 風濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

摘要:目的探討臍帶間充質干細胞(UCMSCs)移植治療大鼠膠原誘導關節炎(CIA)模型的療效。方法40只造模成功的Wistar大鼠隨機分為MSCs移植治療組(MSC組，n=20)、細胞對照組(FLS組，n=10)、疾病對照組(CIA組，n=10)，10只正常的Wistar大鼠作為正常對照組。采用AI評分來評價CIA大鼠關節腫脹程度。第17天予MSC組CIA大鼠尾靜脈注射1×106UCMSCs，FLSs組CIA大鼠尾靜脈注射等量成纖維樣滑膜細胞。第42天處死所有大鼠，外周血分離血清，踝關節HE染色。ELISA法檢測血清中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6水平。踝關節病理評價關節間隙狹窄程度。結果MSC組大鼠關節AI低于FLS組和CIA組(P<0.05); HE染色示CIA大鼠造模后踝關節出現炎性細胞浸潤及關節腔狹窄，但MSC治療組關節間隙明顯好于CIA組和FLS組; CIA組和FLS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于正常對照組，MSC治療組TNF-α、IL-1β、IL-6水平較CIA組和FLS組均有顯著下降(P<0.05); TGF-β在對照組與CIA組間差異無統計學意義，但輸注MSC后TGF-β得到上調(P<0.01)。結論UCMSCs移植能通過抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6, 上調抑炎細胞因子TGF-β來減輕CIA大鼠關節炎癥和軟骨破壞。

關鍵詞:類風濕關節炎; 臍帶間充質干細胞; 膠原誘導關節炎

類風濕關節炎(RA)是以慢性滑膜增殖和進行性關節破壞為特征的全身性自身免疫病，中國RA患病率為0.34%，患病人數達500萬，嚴重危害人們的身體健康。臍帶間充質干細胞(UCMSCs)是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。UCMSCs體外容易擴增，安全性較好，低免疫原性，且具有強大的免疫抑制功能，因此成為自身免疫病細胞治療的首選細胞。有研究者[1-2]證實MSCs能抑制成纖維樣滑膜細胞(FLSs)活化和增殖，從而改善關節炎癥。本科對少數難治性RA患者試用了異體骨髓間充質干細胞移植治療，取得了一定的療效[3]。本研究探討UCMSCs對于膠原誘導關節炎(CIA)模型的治療作用，為臨床進一步推廣應用異基因UCMSCs移植治療RA提供理論依據。

1資料與方法

1.1　實驗材料

50只Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司, 6～8周齡，在無菌層流環境中飼養和實驗。飼料、飲水和墊料均經高壓滅菌處理。臍帶標本取自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院產科，2名順產婦分娩后無菌剪取臍帶組織。滑膜標本取自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院關節外科骨關節炎行膝關節置換術患者，共5例，其中男2例，女3例，年齡47～65歲，平均(56.80±7.16)歲，病程4～13年，平均(8.00±3.39)年。

1.2　主要試劑和儀器

DMEM/F12培養液、胎牛血清、0.25%胰酶購于美國Invitrogen公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma Alorich公司。大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β ELISA試劑盒，鼠抗人異硫氰酸熒光素(FITC)-CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、HLA-G單克隆抗體購自美國eBioscience公司。酶標儀購于美國BioTek公司。

1.3　實驗方法

1.3.1UCMSCs的分離培養及鑒定：無菌條件下取臍帶組織標本，剔除血管，撕取華通膠組織，剪至1 mm×1 mm×1 mm大小，加入少量10% FBS DMEM/F12培養液，每7 d更換一半培養液，第20天待培養瓶底爬出細胞，胰蛋白酶/EDTA 溶液消化細胞，按1∶3傳代，當細胞培養至第3代，經消化重懸制成1×105/mL的單細胞懸液，流式細胞儀檢測CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、HLA-G等表面標記。

1.3.2FLSs分離培養：無菌條件下將滑膜組織標本銳性剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，加入2～3倍體積比1 mg/mL Ⅰ型膠原酶，避光于37 ℃搖動中消化4 h。經200目細胞濾網過濾組織塊后, 1 000 r/min離心5 min, 去上清，加入適量10% FBS DMEM/F12培養液 ，吹打混勻后，于5% CO237 ℃培養箱中靜置培養，每3～4 d更換培養液。當細胞生長至覆蓋底面>80%時，棄培養液，加入胰蛋白酶/EDTA 溶液覆蓋底面。顯微鏡下觀察至大部分細胞變圓后終止消化, 1 000 r/min離心5 min, 棄上清，加入適量培養液吹打混勻后，按1∶3傳代。當細胞培養至第3代，經消化重懸制成1×105/mL的單細胞懸液。

1.3.3CIA大鼠模型建立：無菌條件下，用0.05 mol/L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原(CⅡ), 質量濃度為4 mg/mL。置4 ℃冰箱過夜后，與弗氏佐劑(CFA)等體積混合，振蕩乳化，取乳化液滴入水中不擴散表示乳化充分，制成CⅡ乳劑(CⅡ終濃度為2 mg/mL)。乳化全程冰浴中操作。于雌性Wistar大鼠尾根部、背部兩點皮內注射，總量100 μL。2周后同法100 μL加強注射。

1.3.4關節炎指數(AI)評分：采用AI評分法進行大鼠關節足腫脹評價。評分標準：0分，無關節腫脹; 1分，小趾關節稍紅腫; 2分，趾關節和足趾腫脹; 3分，踝關節以下的足爪腫脹，嚴重紅腫; 4分，包括踝關節在內全部足爪嚴重紅腫，關節活動障礙。四肢的病變程度累積積分為AI，每只大鼠的最高分為16分。每3 d評價1次。

1.3.5大鼠分組處理：第0天予以皮內注射CII乳劑和弗氏完全佐劑混合液，第14天皮內注射CII乳劑和弗氏不完全佐劑混合液，第17天給予20只CIA大鼠尾靜脈注射1×106UCMSCs(MSC組), 10只CIA大鼠尾靜脈注射等量FLSs作為細胞對照組(FLS組), 10只CIA大鼠為疾病對照組(CIA組), 10只正常Wistar大鼠為正常對照組。第42天處死所有大鼠，外周血分離血清，踝關節HE染色。

1.3.6ELISA檢測大鼠血清中細胞因子：大鼠處死前內眥靜脈取外周血2 mL, 1 000 r/min離心10 min, 吸取上清，按ELISA試劑盒指示檢測血清中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6水平。

1.4　統計學處理

數據以均數±標準差表示，采用SPSS 11.5軟件進行統計學處理，采用GraphPad Prism5軟件作圖，多個樣本均數間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1　UCMSCs鑒定

通過流式細胞儀對第3代UCMSCs表面標記物檢測，結果示CD29、CD44、CD73和CD90陽性，HLA-G、CD14、CD34和CD45陰性，符合MSCs特征(圖1)。

圖1 UCMSCs表面標記物

2.2　各組CIA大鼠病情比較

CIA組關節腫脹明顯，MSC治療組關節腫脹程度低于CIA組和FLS組(圖2)；MSC組大鼠關節AI低于FLS組和CIA組(P<0.05)(圖3); HE染色示CIA大鼠造模后踝關節出現炎性細胞浸潤及關節腔狹窄，但MSC治療組關節間隙明顯好于CIA組和FLS組(圖4)。

圖2 各組大鼠關節腫脹程度比較

圖3 各組大鼠關節AI比較

圖4 各組大鼠關節病理檢查結果比較 HE染色

2.3　大鼠外周血細胞因子水平

大鼠各組血清細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β平均值見表1。CIA組和FLS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于正常對照組，UCMSC治療組TNF-α、IL-1β、IL-6水平較CIA組和FLS組均有顯著下降(P<0.05)。MSC治療組炎性細胞因子水平有顯著下調，而FLSs則不能發揮下調作用。盡管抑炎性細胞因子TGF-β在正常與疾病鼠間無顯著差異，但輸注MSC后TGF-β得到上調(P<0.01)。

3討論

RA的主要病變在關節，在關節內可以看到滑膜組織異常增生、大量炎癥細胞浸潤以及軟骨和骨進行性破壞。目前RA治療多采用甲氨蝶呤、來氟米特等慢作用藥物，近年來生物制劑如TNF-α拮抗劑的應用提高了臨床緩解率，使更多的患者受益。盡管諸多藥物的應用和推廣，臨床上仍有部分患者病情難以控制，因此尋找新的治療方法至關重要。MSCs可從骨髓、外周血、臍血、臍帶、牙髓、脂肪組織等多種組織中分離。MSCs不表達HLA-DR和協同刺激分子CD80、CD86, 低表達MHC-I類分子，免疫原性低，移植治療不會導致排斥反應，具有較好的安全性[4-5]。相比于其他來源的MSCs, UCMSCs表達多種胚胎干細胞的特有分子標志，具有分化潛力大、增殖能力強、取材方便等特征。體內和體外研究證實, UCMSCs具有免疫抑制能力，且該能力主要通過分泌可溶性細胞因子或細胞間直接接觸來實現[6-7]。因此成為具有臨床應用前景的多能干細胞[8]。既往研究[9-10]發現, UCMSCs能通過調節患者體內失衡的淋巴細胞亞群，從而有效改善系統性紅斑狼瘡、克羅恩病等多種自身免疫病。

表1　各組大鼠細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β水平比較　pg/mL

TNF-α是RA發病機制中居中心地位的促炎癥性細胞因子，參與RA的發生發展過程。TNF-α通過活化轉錄因子NF-κB和MAPK途徑上調多種致炎細胞因子、趨化因子、黏附分子和生長因子表達；促進血管翳的形成，并抑制調節性T細胞功能[11]; TNF-α還可促使滑膜成纖維細胞、巨噬細胞和軟骨細胞產生IL-1、IL-8及TNF-α本身而加重組織損傷[12]; TNF-α還可直接誘導關節疼痛[13]。目前抗TNF-α治療已廣泛應用于RA臨床治療，取得了顯著療效。IL-1主要由單核巨噬細胞產生，它能促進滑膜細胞和淋巴細胞增殖和分化，促進滑膜細胞合成并釋放前列腺素E2(PGE2)和膠原酶。PGE2和膠原酶引發滑膜炎癥反應、軟骨基質的崩解，而局部免疫復合物、游離的膠原等分解產物又可刺激IL-1的合成[14]。另外，IL-1能刺激滑膜細胞合成過量基質金屬蛋白酶，包括膠原酶和基質溶素，后者能溶解破壞軟骨基質[15]。因此, IL-1是破壞關節軟骨的最重要的細胞因子之一。IL-1和TNF-α都能誘導IL-6的合成和分泌，與IL-1和TNF-α一樣, IL-6也是RA關節炎癥中主要的炎癥介質。在RA中, IL-6的致病作用主要是增強IL-1和TNF-α的效應，促進白細胞活化和自身抗體產生，并與急性時相反應和貧血、脂質代謝紊亂等全身表現相關[16]。目前IL-6單克隆抗體已應用于難治性RA臨床治療，取得不錯的臨床療效[17]。TGF-β是一種抑制炎癥反應的調節因子，由多種細胞產生，主要進入關節滑膜，與基質成分結合在一起，發揮免疫抑制作用。TGF-β還可與細胞毒性T細胞相關抗原-4(CTLA-4)共同作用抑制免疫反應。TGF-β對T、B、巨噬細胞及其他細胞有多重抑制作用[18-19]。

本研究證實, CIA大鼠造模后踝關節出現炎性細胞浸潤及關節腔狹窄，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達增高；經UCMSCs治療后，CIA大鼠關節炎性腫脹減輕，關節間隙未見狹窄；炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達下調，抑炎細胞因子TGF-β表達上調；以上結果提示UCMSCs能通過抑制炎性細胞因子，上調抑炎因子從而緩解關節炎癥，減輕關節破壞。

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Effect observation of umbilical cord-derived

mesenchymal stem cells transplantation on

treatment of collagen-induced arthritis rats

ZHAOCheng,ZHANGLu,WANGHong,LIUBujun

(DepartmentofRheumatology,GulouHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNanjing

University,Nanjing,Jiangsu, 210008)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSCs) transplantation on treatment of collagen-induced arthritis (CIA) rats. MethodsForty CIA model of Wistar rats were randomly divided into MSCs transplantation group (MSC group,n=20), cells control group (FLS group,n=10) and disease control group (CIA group,n=10), and 10 normal Wistar rats were selected as normal control group. AI score was used to evaluate the degree of joint swelling in CIA rats. 1×106UCMSCs or FLSs was given through intravenous injection from tail veil on the 17th day in the MSC group and the FLS group. On the 42nd day, rats were sacrificed and sera were got for detecting TNF-α, TGF-β, IL-1β and IL-6. Ankle joint was got for pathological evaluation of the narrowing degree. ResultsArthritis scores of the MSC group were significantly lower than those of the CIA group and the FLS group (P<0.05). HE staining showed that inflammatory cells infiltration and arthrostenosis were amiliorated by MSC. High serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were down-regulated through UCMSCs transplantation (P<0.05). There was no significant difference of TGF-β between the control group and the CIA group, but up-regulated after the infusion of UCMSCs (P<0.01). ConclusionUCMSCs transplantation can alleviate arthritis and cartilage damage in CIA rats by down regulating inflammatory cytokines of TNF-α, IL-1β, IL-6 and up regulating TGF-β.

KEYWORDS:rheumatoid arthritis; umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; collagen-induced arthritis

基金項目:國家自然科學基金青年基金(81102258)

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號:R 684.3

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201509001

論著