雙酚A對小鼠胚胎干細胞分化潛能的影響

羅凌鳳, 崔 棟, 龔春梅, 吳德生, 黃海燕, 劉建軍, 張文昌, 莊志雄, 楊淋清

(1. 福建醫科大學公共衛生學院環境與健康重點實驗室, 福建 福州 350108; 2. 深圳市疾病預防控制中心現代毒理學重點實驗室 深圳市衛生毒理學重點實驗室, 廣東 深圳 518055;3. 深圳市慢性病防治中心, 廣東 深圳 518020)

雙酚A對小鼠胚胎干細胞分化潛能的影響

羅凌鳳1, 崔 棟2, 龔春梅3, 吳德生2, 黃海燕2, 劉建軍2, 張文昌1, 莊志雄2, 楊淋清2

(1. 福建醫科大學公共衛生學院環境與健康重點實驗室, 福建 福州 350108; 2. 深圳市疾病預防控制中心現代毒理學重點實驗室 深圳市衛生毒理學重點實驗室, 廣東 深圳 518055;3. 深圳市慢性病防治中心, 廣東 深圳 518020)

目的 探討雙酚A(BPA)對胚胎干細胞(ESC)分化潛能的影響，為合理評價BPA的安全性提供實驗基礎。方法 制備及培養的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和小鼠ESC，用BPA 0.1, 1, 10, 100和1000 μmol·L-1持續培養8 d，CCK-8法檢測MEF和ESC細胞存活率并計算IC50；通過實時熒光定量PCR檢測ESC中α肌球蛋白重鏈mRNA表達并計算其半數最大分化抑制濃度 (ID50)。懸滴懸浮法培養的擬胚體，用BPA 0.001, 0.01, 0.1和1 μmol·L-1持續培養10 d，實時熒光定量PCR檢測擬胚體各胚層標志基因表達的變化。結果 BPA對小鼠ESC的IC50為5.22×10-4mol·L-1，對MEF的IC50為6.25×10-4mol·L-1，對小鼠ESC體外心肌細胞定向分化的ID50為7.0×10-7mol·L-1。BPA 0.001和0.01 μmol·L-1可以上調擬胚體的中胚層標志基因胎肝激酶1和球蛋白轉錄因子1的表達。結論 BPA屬于強胚胎毒性化合物。低濃度BPA對小鼠ESC分化為中胚層細胞有促進分化的作用。

雙酚A; 胚胎干細胞; 藥物毒性

雙酚A(bisphenol A ,BPA)作為一種單體物質應用于生產聚碳酸酯、環氧樹脂和酚醛樹脂的過程中, 在生產罐頭內包裝、食品包裝材料、牙科填充劑和嬰兒用瓶等塑料行業有廣泛的用途。BPA是環境中常見的內分泌干擾化合物，人類在生產生活中不可避免長期、低劑量和反復接觸BPA。有研究報道其普遍存在于人體組織和體液中，在胎盤組織、臍帶血、胎兒和嬰幼兒體液尤為明顯[1]，其毒性及健康風險一直以來廣為關注，是環境和健康研究領域的研究熱點。已有研究表明，BPA在一定劑量水平能抑制胚胎發育[2]；引起子代大鼠生殖發育障礙[3]；可導致胎兒出生體質量的下降，陰道和子宮質量下降, 陰道開口期提前,出現囊狀卵泡及改變乳腺結構而誘發乳腺癌等[4]。但因受實驗技術手段和醫學倫理學方面的限制，難以開展早期胚胎宮內研究，因而對BPA對胎兒早期發育的影響及其機制知之甚少，且主要停留在動物實驗階段[3,5]。

傳統的發育毒性評價模型實驗周期長，費用較高，需要消耗大量的實驗動物，無法滿足對大量新型受試物進行評價的要求。針對這種狀況，歐洲替代方法驗證中心將依據胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)多向分化的特性而建立的ESC實驗方法(ESC test, EST)作為體外篩選和評價受試物發育毒性的方法，目前已被學術界普遍接受，并成為完備相關發育毒性安全性資料的重要手段之一[6]。EST是一種體外替代實驗方法，利用小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)和ESC，進行細胞毒性實驗和ESC分化抑制實驗，根據已建立的預測模型，對受試物的胚胎毒性進行評價。鑒于BPA在整體動物實驗中表現出的胚胎毒性，本研究采用小鼠EST模型對BPA的胚胎毒性進行初步的研究，為完善BPA的毒性及安全性評價提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞7～9周齡清潔級C57/BL6系小鼠20只，雌雄各半，體質量32～36 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，用于分離培養MEF；S6系小鼠ESC，購自上海斯丹賽有限公司。1.2 試劑和儀器BPA購自日本Wako公司; 雌二醇(estradiol, E2)和明膠購自美國Sigma公司；knock-out DMEM培養基、胎牛血清、左旋谷氨酰胺、β-巰基乙醇(β-ME)、非必需氨基酸 (NEAA)和胰酶等購自美國Gibco公司；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)購自美國Millipore公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；細胞總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。HFSafe-1200/C型生物安全柜(上海力申科學儀器公司)，HF212uv型CO2培養箱(上海力申科學儀器公司)，CK40-F200 BH-2倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Model3550型多功能酶標儀(美國伯樂公司)，GS-15R臺式冷凍離心機(美國Beckman公司)，Biophotometer 型生物分光光度計(德國Eppendorf 公司)，ABI PRISM 7900HT(美國Applied Biosysterms公司)，冷凝CCD成像系統(美國GE公司)。

1.3 小鼠MEF制備[7]和ESC培養[8]選擇孕12.5～14.5 d的C57/BL6系清潔級小鼠，無菌條件下分離得到MEF，培養箱中培養傳代，收集第3代細胞，用gama射線輻照儀，50～80 Gy輻照后，按約60 000 cm-2標準凍存備用。取出-196℃液氮中保存的小鼠ESC細胞進行細胞復蘇，接種于備用的飼養層細胞上，加入含15%胎牛血清的小鼠ESC培養基進行維持培養，當ESC集落達70%～80%融合時，開始傳代。

1.4 CCK-8方法檢測MEF和ESC的存活[9]分別將500個(50 μL)C57/BL6 MEF細胞和小鼠ESC細胞接種在96孔板上，MEF用常規DMEM培養基，小鼠ESC用分化培養液，培養2 h，使細胞貼壁。然后，每孔加入150 μL BPA 0.1, 1, 10, 100和1000 μmol·L-1，同時設DMSO溶劑對照，3 d換液1次，持續培養8 d，第8天用CCK-8試劑檢測細胞活性，于波長450 nm處檢測吸光度值(A450 nm)，計算細胞存活率。存活率(%)=1- (A450 nm溶劑對照組-A450 nm染毒組)/(A450 nm溶劑對照組-A450 nm培養基對照)×100%，繪制濃度-反應曲線，運用SPSS11.5統計軟件進行probit概率單位模型分析，計算ESC的IC50和MEF的IC50。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測心肌細胞特異基因α肌球蛋白重鏈 (α-myosin heavy chain,α-MHC) 基因表達設BPA 0.1, 1, 10, 100和1000 μmol·L-1組，同時設DMSO溶劑對照組，用ESC分化培養基制備BPA，加入經胰酶消化的ESC細胞懸液(3.75×107 L-1)。吸取20 μL細胞懸液于100 mm組織培養皿，培養皿中加10 mL PBS。在濕潤條件37℃, 5%CO2，懸滴培養3 d，形成細胞集落。吸取5 mL含BPA的培養基于懸滴的培養皿蓋子中，蓋子傾斜約45°使細胞滑落底部，用移液器輕輕將總的細胞懸液移至60 mm的細菌培養皿中，懸浮培養2 d。將形成的擬胚體轉移到每孔含有1 mL BPA 的24孔板中，每孔1個擬胚體，繼續培養3 d。實驗第9天時，光鏡下觀察分化為心肌細胞的情況，收集培養的細胞，用Trizol法提取RNA，采用2-△△Ct計算α-MHC基因表達。α-MHC的引物：上游ACCTGTCCAAGTTCCGCAAG，下游 CTTGTTGACCTGGGACTCGG；GAPDH的引物：上游GCACAGTCAAGGCCGAGAAT，下游：GCCTTCTCCATGGTGGTGAA。以X軸為受試物濃度的對數，Y軸為α-MHC的相對表達量，繪制濃度-反應曲線，運用SPSS11.5統計軟件進行Probit概率單位模型分析，計算得到半數最大分化抑制濃度(ID50)。

1.6 判別函數方法判定BPA胚胎毒性[10]利用EST的3個反應終點(IC50MEF, IC50ESC和ID50)對檢測物質的胚胎毒性進行判斷。具體表現為通過比較3個含有3個反應終點的線性判別函數之間的大小，從而對胚胎毒性的強弱進行分類。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測各胚層標志性基因mRNA表達按1.5懸滴懸浮培養方法制備并培養擬胚體，分為BPA 0.001, 0.01, 0.1和1 μmol·L-1處理組，同時設E2 0.001 μmol·L-1陽性對照組和DMSO溶劑對照組，持續處理10 d后，擬胚體用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化下來后，PBS洗1次，按試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度計定量，并按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。利用Primer3軟件設計基因的引物并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，各基因引物具體序列見表1, 以β肌動蛋白為內參基因。按TaKaRa試劑盒說明書配制反應體系，在ABI PRISM 7900HT熒光定量PCR儀上進心熒光定量PCR檢測，反應結束后，應用儀器自帶的軟件計算并分析結果，采用2-△△Ct計算各基因mRNA的相對表達水平。

1.8 統計學分析ID50和IC50計算方法采用運用SPSS11.5軟件對細胞吸光度值和濃度數據進行Probit概率單位模型分析，得出ID50和IC50。將3次獨立重復實驗數據經Excel 2007軟件整理后，采用SPSS11.5統計分析軟件，將數據進行正態性檢驗，符合正態分布的數據，吸光度值及細胞抑制率、相關基因mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Primer sequence of real-time PCR

GenePrimerLength/bpVimentinForward5′AAGCAGGAGTCAAACGAGTA3′314Reverse5′GTTGGCAGAGGCAGAGAAAT3′NestinForward5′CTCTCCCTGACTCTACTCCCT3′347Reverse5′CATCTTCTTCCTCTCCCTCTT3′Flk?1Forward5′TAGGTGCCTCCCCATACCCTGG3′398Reverse5′TGGCCGGCTCTTTCGCTTACTG3′Gata?1Forward5′TTGGACACCTTGAAGACGG3′745Reverse5′GCATAAGATGGCTGACAGGC3′AFPForward5′GCTCACACCAAAGCGTCAAC3′410Reverse5′CCTGTGAACTCTGGTATCAG3′TTRForward5′AGTCCTGGATGCTGTCCGAG3′440Reverse5′TTCCTGAGCTGCTAACACGG3′β?ActinForward5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′150Reverse5′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3′

Flk-1: fetal liver kinase 1;Gata-1: globin transcription factor-1;AFP: α-fetal protein;TTR: transthyretin.

2 結果

2.1 BPA對小鼠ESC和MEF細胞存活率的影響CCK-8檢測結果顯示(圖1A和B)，BPA對小鼠ESC和MEF的影響隨著染毒濃度的增加，細胞活力逐漸減小。MEF的IC50為6.25×10-4 mol·L-1，小鼠ESC的IC50為5.22×10-4 mol·L-1。從以上結果可看出，小鼠ESC對BPA的敏感性稍微高于MEF細胞。

2.3 BPA的胚胎毒性界別判定根據EST得到其3個反應終點IC50ESC，IC50MEF和ID50分別為5.22×10-4, 6.25×10-4和7.0×10-7 mol·L-1，其中IC50ESCⅠ且Ⅲ>Ⅱ，根據模型判斷標準， BPA屬于強胚胎毒性化合物。

Fig.4 Effect of BPA on mRNA expression of embryonic bodys.

3 討論

本研究結果發現，BPA對小鼠MEF和ESC的作用呈濃度依賴性，屬于強胚胎毒性化合物，這與體內動物實驗的結果[11-12]及體外胚胎培養實驗結果[13]相一致。然而， Kong等[14]應用3T3細胞和D3系ESC成功建立的EST模型，評價BPA屬于弱胚胎毒性化合物，與本研究的不同之處，考慮與選取細胞系以及EST對胚胎毒性強弱的預測能力的不同，EST模型中ES細胞對受試物毒性的敏感性高于成體細胞，以及選取的BPA溶度范圍的不同等原因有關，同時這也預示了BPA的實際暴露量更應該得到高度重視。Schwengberg等[15]采用EST標準實驗方案對牙科填充化學物的胚胎毒性進行評價，結果發現，雙酚A甲基丙烯酸縮水甘油酯(BisGMA)對小鼠ESC毒性影響的IC50為1×10-5mol·L-1，在BPA濃度為1×10-7～1×10-6mol·L-1時， ESC分化受到明顯抑制，這與本研究的結果也是基本接近的。以上結果表明，本研究采用S6系小鼠ESC建立的EST實驗體系可以用于檢測外源化學物的胚胎毒性。ESC是一類高度未分化的細胞，具備多能性和自我更新特性，在模擬體內胚胎發育的過程，可將ESC體外懸滴懸浮培養分化為胚胎樣聚集體,即擬胚體，擬胚體進一步分化為外胚層、中胚層和內胚層起源的原始胚層細胞。本研究結合前期實驗基礎上得到的ESC IC50和相關文獻，確定BPA染毒擬胚體的濃度，對10 d的擬胚體3胚層標志性基因表達量進行檢測。結果發現，在一定濃度范圍內，BPA對內胚層特征性基因及外胚層特征性基因的影響不明顯，而對中胚層特征性基因(Flk-1,Gata-1)有影響，表現為先升高后降低的趨勢，BPA 1和10 nmol·L-1濃度使其升高，表明在較低濃度范圍內的BPA對小鼠ESC的分化潛能有影響，尤其在分化為中胚層細胞影響較大，促進其向中胚層細胞分化。中胚層是在3胚層動物的胚胎發育過程中，(原腸胚末期)處在外胚層和內胚層之間的細胞層，中胚層最終發育為軀體的真皮、肌肉和生殖系統器官等[16]。近期也有相關研究發現，一定濃度范圍內BPA可上調多能性相關基因(OCT4, SOX2和Nanog)的mRNA及蛋白表達水平，同時可增加中胚層標志物〔Sma和結蛋白(desmin)〕的mRNA表達水平，促進其向中胚層分化，并揭示了miR-134在其中胚層譜系分化中起到關鍵作用[17]。因此，BPA在較低濃度范圍內可影響ESC自發分化為擬胚體的過程及其轉歸，但其具體基因調節機制目前尚未完全清楚，因此還需進一步研究。

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(本文編輯: 喬 虹)

Effect of bisphenol A on differentiation potential of mouseembryonic stem cells

LUO Ling-feng1, CUI Dong2, GONG Chun-mei3, WU De-sheng2, HUANG Hai-yan2,LIU Jian-jun2, ZHANG Wen-chang1, ZHUANG Zhi-xiong2, YANG Lin-qing2

(1.KeyLaboratoryofEnvironmentalandHealth,SchoolofPublicHealth,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China; 2.KeyLaboratoryofModernToxicology,MedicalKeyLaboratoryofHealthToxicology,ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China; 3.ShenzhenCenterforChronicDiseasePrevention,Shenzhen518020,China)

OBJECTIVE To explore the effect of bisphenol A (BPA) on the differentiation potential of embryonic stem cells, and provide an experimental basis for evaluation of safety of BPA. METHODSMouse embryonic fibroblasts (MEFs) and embryonic stem cells (ESCs) were treated with BPA 0.1, 1, 10, 100 and 1000 μmol·L-1for 8 d respectively. The viability of MEFs and ESCs was measured by CCK-8 and IC50was calculated. The mRNA expression of α-myosin heavy chain in ESCs was tested by RT-PCR to determine ID50. The embryonic body cultured by suspension method was treated with BPA 0.001, 0.01, 0.1 and 1 μmol·L-1for 10 d respectively. The changes of marked genes in each blastoderm were detected by RT-PCR. RESULTS IC50of BPA to mouse ESCs was 5.22×10-4mol·L-1, and to MEFs was 6.25×10-4mol·L-1. ID50of BPA to mouse ESCs differentiating to cardiomyocytes was 7.0×10-7mol·L-1. BPA 0.001 and 0.01 μmol·L-1upregulated the expression of the marked genes of mesoderm, fetal liver kinase-1 and globin transcription factor 1. CONCLUSION BPA is a strong embryotoxic compound. BPA of low concentration can promote the differentiation of mouse ESCs to mesoderm.Key words: bisphenol A; embryonic stem cells; drug toxicity

YANG Lin-qing, E-mail: linqingyang@126.com

國家自然科學基金(81172710)；深圳市科技研發資金基礎研究計劃(JC201105180762A)；深圳市科技計劃項目(201202097); 廣東省醫學科研基金(A2014644)

羅凌鳳，女，助理實驗師，主要從事生殖毒性研究。

楊淋清, E-mail: linqingyang@126.com

Foundation item: The project supported by National Natrual Science Foundation of China(81172710); Basic Research Program of Shenzhen Municipal Science and Technology(JC201105180762A); Shenzhen Science and Technology Program(201202097); and Medical Science Research Foundation of Guangdong Province(A2014644)

2014-02-28 接受日期: 2014-12-20)

R994.3

A

1000-3002(2015)02-0291-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.017

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