過氧化氫對NIH/3T3細胞蛋白磷酸酶2A催化亞基C甲基化的影響

劉銀品, 唐 深, 陸彩玲, 秦 富, 孫 斌, 許 揚, 李習藝

(廣西醫科大學 1. 公共衛生學院營養與食品衛生教研室, 2. 基礎醫學院, 廣西 南寧 530021)

過氧化氫對NIH/3T3細胞蛋白磷酸酶2A催化亞基C甲基化的影響

劉銀品1, 唐 深2, 陸彩玲1, 秦 富1, 孫 斌1, 許 揚1, 李習藝1

(廣西醫科大學 1. 公共衛生學院營養與食品衛生教研室, 2. 基礎醫學院, 廣西 南寧 530021)

目的 探討過氧化氫(H2O2)對NIH/3T3細胞中蛋白磷酸酶2A催化亞基C(PP2Ac)甲基化的影響。方法 ① H2O20，0.1，1，5，10和25 mmol·L-1刺激NIH/3T3細胞1 h，刃天青還原率檢測細胞活性；② Western蛋白印跡法檢測H2O20，0.1，1和5 mmol·L-1作用1 h后細胞內去甲基PP2Ac的表達；③ 分別用羧基端甲基酯酶(PME-1)抑制劑AMZ30 0，0.1，0.5，1.0，5.0和10.0 μmol·L-1和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)0，0.5，1和5 mmol·L-1預處理細胞30 min，再用H2O21 mmol·L-1作用細胞1 h，Western蛋白印跡法檢測細胞內去甲基PP2Ac的表達；④ 免疫熒光實驗觀察NIH/3T3細胞H2O21 mmol·L-1處理1 h、AMZ30 10.0 μmol·L-1或NAC 1 mmol·L-1分別預處理30 min后再加H2O21 mmol·L-1處理1 h細胞內去甲基PP2Ac的表達。結果 ① 刃天青檢測實驗結果顯示，H2O2對細胞增殖具有顯著的抑制作用，濃度≥0.1 mmol·L-1細胞活性顯著降低(P<0.01)；② Western蛋白印跡檢測結果顯示，H2O2可致NIH/3T3細胞內去甲基PP2Ac蛋白表達升高，H2O20.1，1和5 mmol·L-1組與空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)；③ Western蛋白印跡結果顯示，AMZ30與NAC二者均可拮抗H2O2對細胞內PP2Ac去甲基的作用，與H2O21 mmol·L-1組相比，加入AMZ30 5.0和10.0 μmol·L-1或NAC 1和5 mmol·L-1細胞內去甲基PP2Ac含量明顯降低(P<0.01)；④ 免疫熒光實驗結果顯示，加入H2O21 mmol·L-1刺激1 h后，細胞內去甲基PP2Ac的表達要高于正常細胞組，而用AMZ30 10.0 μmol·L-1與NAC 1 mmol·L-1干預后，去甲基PP2Ac表達降低。結論 H2O2可誘導NIH/3T3細胞內PP2Ac去甲基，而PME-1抑制劑AMZ30和抗氧化劑NAC均能拮抗H2O2誘導的PP2Ac去甲基作用。

過氧化氫; 磷蛋白磷酸酶; 甲基化

氧化應激參與多種生理及病理過程，氧化應激產生活性氧自由基造成細胞氧化損傷是多種化學物毒作用的普遍機制之一。H2O2是細胞內主要的活性氧自由基，既可直接造成生物大分子物質的氧化損傷，也可作為第二信使，參與氧化應激相關信號轉導途徑調控[1]。研究H2O2在細胞分子傳導、蛋白調控過程中的作用，對深入理解氧化損傷機制、尋找氧化型損傷的防治靶點具有重要理論及現實意義。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是一種在細胞內重要而又普遍表達的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，它參與許多重要的細胞進程，如DNA損傷修復[2]、細胞凋亡和抑制癌癥信號轉導通路[3]等。PP2A由結構亞基A、調節亞基B和催化亞基C(PP2Ac)三部分組成的，其中PP2Ac對PP2A的活性具有重要的調節作用[4]。PP2Ac的結構中含有一段序列高度保守的游離羧基尾巴，其羧基端L309受甲基化修飾調控，可在亮氨酸甲基轉移酶的作用下發生甲基化，在羧基端甲基酯酶1(PP2A methylesterase 1，PME-1)的催化下去甲基[5]，這種可逆的甲基化作用是調節PP2A生物學功能的重要機制之一，在PP2A活性及其底物特異性調控中具有重要作用[6-7]。研究表明，PP2A是一種氧化敏感型蛋白[8]，但氧化應激對PP2Ac甲基化的調控作用尚未明確。Bachovchin等[9-10]通過文庫篩查發現了幾類能有效抑制PME-1活性的化合物，它們能與PME-1共價結合，特異性抑制其活性而不影響其他蛋白功能，為了解氧化應激在PP2Ac甲基化調控的機制提供了研究思路。本研究以NIH/3T3細胞為研究對象，用H2O2制備細胞的氧化應激模型，探討H2O2誘導的氧化應激對PP2Ac甲基化修飾的調控以及PME-1抑制劑AMZ30和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)對其的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器DMEM培養基(美國Gibco公司)，新生小牛血清(中國杭州四季青公司)，AMZ30(德國Merck公司)，NAC(中國碧云天公司)，去甲基化PP2Ac抗體(ab32104)和總PP2Ac抗體(ab32065，英國Abcam公司)，β肌動蛋白、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(ZB-5301)和羊抗鼠IgG(ZB-5305，中國中杉金橋)，刃天青(resazurin, 美國Sigma公司)，0.45 nm NC膜(美國Millipore公司)，30% H2O2和其余試劑均為國產分析純。Forma 3111型CO2恒溫培養箱和Multiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo公司)，垂直電泳槽和伯樂通用型電泳儀Biorad Powerpac Universal(美國Bio-Rad公司)，Ti-s倒置生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 細胞和培養NIH/3T3細胞由廣西醫科大學實驗中心提供，用含10%新生小牛血清的DMEM培養基在37℃，5%CO2培養箱中培養，實驗選用對數生長期細胞。

1.3 刃天青檢測NIH/3T3細胞存活[11] 取NIH/3T3細胞接種于96孔板中，每孔100 μL(約含細胞數1×104)，分成6個組，分別用PBS及H2O2 0.1，1，5，10和25 mmol·L-1處理1 h，設8個復孔，染毒結束后取出96孔板，吸出原培養基，用PBS洗滌1次，最后各孔加入100 μL含0.001%刃天青的培養液繼續放入培養箱孵育2～4 h，用酶標儀在雙波長570和600 nm下檢測吸光度(A)值，計算細胞相對活性。細胞相對活性(%)=給藥組A/對照組A×100%。

1.4 Western 蛋白印跡法檢測NIH/3T3細胞去甲基PP2Ac和總PP2Ac蛋白的表達將NIH/3T3細胞接種于6孔板中，待細胞鋪滿底壁>80%后分別給予PBS及H2O2 0.1，1和5 mmol·L-1處理1 h，染毒結束后棄上清，提取蛋白，將裂解液收集于1.5 mL EP管，振蕩器振蕩1 min，10 000×g離心30 min，BCA法進行定量后，加入等體積2×上樣緩沖液(mL: 20%SDS 40；甘油10；1.0 mol·L-1 Tris-HCl 25, pH 6.8；β-巰基乙醇5；加ddH2O定容至100)混勻，放入-20℃備用。配置4%濃縮膠和10%分離膠，上樣(各組取25 μg)，100 V電泳90 min，100 V轉膜1 h，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉30 min，以β肌動蛋白為內參，一抗4℃孵育6 h或過夜，PBST漂洗3次，二抗室溫孵育2 h，PBST漂洗3次，ECL顯色，凝膠成像系統拍照，條帶用Image j軟件進行分析，以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度比值，表示蛋白相對表達水平。實驗重復3次。

1.5 Western 蛋白印跡法檢測AMZ30和NAC干預后細胞內去甲基PP2Ac和總PP2Ac蛋白的表達將細胞分成9組，各組先分別用PBS，AMZ30 0.1，0.5，1.0，5.0和10.0 μmol·L-1及NAC 0.5, 1和5 mmol·L-1預處理30 min，然后再在各培養基中加入終濃度為1 mmol·L-1的H2O2繼續培養1 h，染毒結束后棄上清，提取蛋白，按1.4進行蛋白檢測。

1.6 免疫熒光法檢測去甲基PP2Ac在細胞內表達將細胞接種于6孔板，其中4個孔中，每孔1.5 mL(約含細胞數1×104)，放入培養箱過夜，待細胞完全貼壁后進行分組處理，其中2組分別用AMZ30 10 μmol·L-1和NAC 1 mol·L-1預處理30 min，然后加入H2O2 1 mmol·L-1繼續培養培養1 h，設正常細胞組作為空白對照。染毒結束后棄上清，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.5% TritonX-100透化30 min，PBS洗3次，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃ 4 h，PBS洗3次，二抗室溫避光孵育2 h，PBS洗3次，DAPI避光孵育15 min，PBS洗1次，熒光顯微鏡拍照。

2 結果

2.1 H2O2對NIH/3T3細胞存活的影響刃天青還原率實驗結果(表1)顯示，隨著H2O2濃度增加，NIH/3T3細胞增殖抑制越明顯，與正常細胞對照組相比，H2O2 0.1，1，5，10和25 mmol·L-1處理細胞1 h后，細胞存活率顯著降低(P<0.01)。

Tab.1 Effect of H2O2on NIH/3T3 cell viability

H2O2/mmol·L-1ACellviability/%01．000±0．000100．0±0．00．10．956±0．022??95．6±2．2??10．904±0．050??90．4±5．0??50．772±0．039??77．2±3．9??100．568±0．050??56．8±5．0??250．171±0．015??17．1±1．5??

2.2 H2O2對NIH/3T3細胞PP2Ac甲基化的影響Western蛋白印跡結果顯示(圖1)，與正常細胞組相比，各H2O2濃度組細胞內去甲基化PP2Ac表達明顯增加(P<0.01)，而細胞內總PP2Ac表達未見明顯變化，提示細胞內PP2Ac在氧化應激調控下自身會發生去甲基化，但其總量并不會有改變。

2.3 AMZ30和NAC對H2O2誘導的細胞內PP2Ac去甲基的影響Western蛋白印跡結果(圖2)所示，AMZ30可抑制H2O2對細胞內PP2Ac去甲基化的作用，與單獨H2O2處理組相比，AMZ30 5和10 μmol·L-1預處理組細胞內去甲基PP2Ac表達顯著下調(P<0.01)，對總PP2Ac表達無影響(數據略)。提示PME-1參與了氧化應激調控時PP2Ac的去甲基作用。

Western蛋白印跡結果顯示(圖3)，與單獨H2O2處理組相比， NAC 1及5 mmol·L-1預處理組細胞內去甲基PP2Ac表達顯著降低(P<0.01)，總PP2Ac無變化。說明NAC可抑制H2O2對細胞內PP2Ac的去甲基作用。

2.4 AMZ30和NAC對H2O2誘導的細胞內去甲基PP2Ac表達的影響由圖4可見，加入H2O2 1 mmol·L-1刺激1 h，細胞內去甲基PP2Ac熒光強度增強(圖4A1)；而AMZ30和NAC預處理后再給予H2O2 刺激，則細胞內去甲基PP2Ac熒光強度明顯低于單獨H2O2刺激(圖4C1,D1)，與Western蛋白印跡實驗結果一致。

Fig.4 Expression of unmet-PP2Ac in NIH/3T3 cells by immunofluorescence analysis (×400). A: normal control group; B: H2O21 mmol·L-1group; C: H2O21 mmol·L-1+AMZ30 10 μmol·L-1group; D: H2O21 mmol·L-1+NAC 1 mmol·L-1group. 1: un-methylated PP2Ac; 2: DAPI; 3: merge pictures of 1 and 2.

3 討論

本研究結果顯示，H2O2能對NIH/3T3細胞造成明顯的氧化損傷作用，使細胞存活率下降，細胞內去甲基PP2Ac表達增加，抗氧化劑能可逆性地調控PP2Ac甲基化，提示PP2Ac甲基化在氧化應激信號轉導通路中可能具有重要調控作用。有研究顯示，PP2A與PP1共調控細胞內約90%的絲、蘇氨酸蛋白磷酸化，細胞內約1/3的蛋白受絲、蘇氨酸磷酸化調控。此外，PP2A處于信號轉導通路的上游，對多條細胞內重要的信號轉導途徑有調控作用[12]。因此，我們認為PP2Ac甲基化或許可作為敏感的分子開關，受到氧化應激刺激后迅速反應，通過改變PP2A功能及底物特異性，調控下游蛋白磷酸化修飾，從而激活或抑制下游通路，介導生物學功能。PME-1是細胞內催化PP2Ac去甲基的酶。研究顯示，PME-1敲除小鼠在圍產期死亡[13]，提示PME-1對機體的正常發育具有重要作用。本研究結果表明，PME-1受到抑制后再使用H2O2刺激細胞，細胞內的去甲基PP2Ac表達明顯受到抑制，說明當細胞發生氧化應激時，PP2Ac會通過自身的甲基化變化來參與細胞的調控。綜上所述，PME-1參與H2O2誘導的PP2Ac去甲基，提示PME-1可能成為潛在的氧化型損傷防治靶點，但PME-1在氧化應激反應中的具體作用還有待進一步研究。

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(本文編輯: 喬 虹)

Effect of hydrogen peroxide on protein phosphatase 2A catalyticsubunit C methylation in NIH/3T3 cells

LIU Yin-pin1, TANG Shen2, LU Cai-ling1, QIN Fu1, SUN Bin1, XU Yang1, LI Xi-yi1

(1.DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth, 2.CollegeofBasicMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

OBJECTIVE To investigate the effect of hydrogen peroxide(H2O2) on protein phosphatase 2A catalytic subunit C(PP2Ac) methylation. METHODS After H2O20, 0.1, 1, 5, 10 and 25 mmol·L-1treatment of NIH/3T3 cells for 1 h, the rate of resazurin reduction was observed to determine the cell proliferation while Western blotting was used to detect the expression of un-methylated PP2Ac. PP2A methylesterase (PME-1) inhibitor AMZ30 0, 0.1, 0.5, 1, 5 and 10 μmol·L-1and antioxidant NAC 0, 0.5, 1 and 5 mmol·L-1were used to intervene in the effect of H2O21 mmol·L-1on NIH/3T3 cells. After various treatments, the expression of un-methylated PP2Ac was detected by Western blotting and indirect immunofluorescence. RESULTS Compared with normal control group, H2O20.1, 1, 5 and 25 mmol·L-1significantly decreased the cell proliferation(P<0.01). The expression of un-methylated PP2Ac in NIH/3T3 cells and in H2O20.1, 1 and 5 mmol·L-1groups was significantly increased(P<0.01) compared with normal control group. Western blotting results revealed that both NAC (1 or 5 mmol·L-1) and AMZ30 (5 or 10 μmol·L-1) significantly antagonized the effect of H2O2on PP2Ac(P<0.01). Indirect immunofluorescence results showed that the un-methylated PP2Ac expression of H2O21 mmol·L-1group was higher than that of normal control group, while the expression of PP2Ac methylation was reduced after the use of AMZ30 10 μmol·L-1or NAC 1 mmol·L-1. CONCLUSION H2O2can induce demethylation of PP2Ac in NIH/3T3 cells, while the PME-1 inhibitor AMZ30 and antioxidant NAC can antagonize the methylation of PP2Ac induced by H2O2.

hydrogen peroxide; phosphoprotein phosphatase; methylation

LI Xi-yi, E-mail: leeciyee@163.com

國家自然科學基金(81360428); 廣西壯族自治區自然科學基金(2014GXNSFAA118188)

劉銀品，碩士研究生，主要從事營養與食品衛生研究。

李習藝, E-mail: leeciyee@163.com

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China(81360428); and Natural Science Foundation of Guangxi Zhuangzu Autonomous Region(2014GXNSFAA118188)

2014-08-04 接受日期: 2015-02-15)

R966

A

1000-3002(2015)02-0272-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.014

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