神經元特異性烯醇化酶在神經元氧糖剝奪損傷模型復氧后的表達變化

徐偉華，趙 冬，戴 晶，劉 祺，許 暉，黃嘯元，王業忠

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·論著·

神經元特異性烯醇化酶在神經元氧糖剝奪損傷模型復氧后的表達變化

徐偉華，趙 冬，戴 晶，劉 祺，許 暉，黃嘯元，王業忠

目的 探討神經元特異性烯醇化酶(NSE)在體外培養神經元氧糖剝奪損傷模型復氧后的水平變化。方法 體外原代培養24 h內的新生SD大鼠海馬區神經元，應用免疫熒光染色及電子顯微鏡鑒定神經元，應用體外氧糖剝奪建立大鼠海馬區神經元缺血低氧損傷模型，分別對復氧1、6、12、24、48、72 h神經元提取蛋白質，Western blotting法檢測不同時間點神經元損傷模型中NSE表達水平。結果 培養第4天的細胞免疫熒光染色顯示神經元細胞核染色清晰，形態典型，突起走形如網狀，陽性率為(93.6±1.6)%。各組NSE蛋白表達比較，差異有統計學意義(F=500.75，P<0.01)。實驗組損傷后各時間點NSE蛋白表達高于對照組，細胞培養24、48 h NSE蛋白表達均高于其他時間點(P<0.05)。結論 NSE可作為自發性蛛網膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)標志物，能夠反映腦組織的損傷程度。

蛛網膜下腔出血；原代細胞培養；海馬；神經元；氧糖剝奪；神經元特異性烯醇化酶

徐偉華，趙冬，戴晶，等.神經元特異性烯醇化酶在神經元氧糖剝奪損傷模型復氧后的表達變化[J].中國全科醫學，2015，18(20)：2444-2447.[www.chinagp.net]

Xu WH，Zhao D，Dai J，et al.Changes of the expression of neuron specific enolase after the reoxygenation of neuron model damaged by oxygen-glucose deprivation[J].Chinese General Practice，2015，18(20)：2444-2447.

自發性蛛網膜下腔出血(spontaneous subarachnoid hemorrhage，SAH)后早期腦損傷(early brain injury，EBI)是導致SAH患者死亡風險升高和不良預后的首要原因[1]，而海馬區神經元是腦損傷最敏感的部位。神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)在腦損傷診斷及患者預后評估中起重要作用[2]。本課題前期體外實驗通過建立大鼠SAH模型，于傷后1、6、12、24、48、72 h時采用酶標免疫檢測法(ELTSA)檢測SD大鼠腦組織NSE水平，原位末端轉移酶標記(TUNEL)法檢測大鼠腦組織海馬區神經元凋亡情況，初步證實：NSE表達水平與細胞凋亡數呈正相關。本研究通過體外培養神經元，建立損傷模型，探討神經元損傷與NSE表達水平變化，判斷不同時間點神經元損傷的嚴重程度，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取新生24 h內SD大鼠3～4只，雌雄不限，SPF級，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要化學試劑 DMEM/F12(Hyclone公司)，Neurobasal A medium(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，B-27添加劑(Gibco公司)，左旋多聚賴氨酸(PLL，Sigma公司)，胰蛋白酶(Amerisco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone公司)，10 000 U/ml青霉素、10 000 U/ml鏈霉素和L-谷氨酰胺(Gibco公司)，NSE多克隆抗體(Gibco公司)，無血清培養基：Neurobasal培養基+2% B-27添加劑(50×)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，于冰箱4 ℃保存備用；多聚-L-賴氨酸包被液：采用PBS配制1 mg/ml多聚-L-賴氨酸溶液，0.22 μm濾器過濾除菌，4 ℃保存備用。

1.3 大鼠大腦皮質神經元的分離及培養 取SD大鼠，常規碘伏消毒3遍后，75%乙醇消毒3遍，無菌條件下持眼科剪沿正中線剪開頭皮與顱骨，暴露兩側大腦半球，用眼科無齒鑷迅速取出整個腦組織，放入冰上盛有PBS的玻璃培養皿中，仔細剝離腦組織表面血管及腦膜，去除小腦、腦干，分離大腦皮質，PBS清洗2～3遍(去除紅細胞)后，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，以0.25%胰蛋白酶在37 ℃ 5%CO2培養箱中消化10～15 min(其間振蕩3次)，加入種植培養基(90% DMEM-F12+10% FBS)終止消化3～5 min，去除終止消化液，加入5 ml種植培養基(90% DMEM-F12+10% FBS)后將大腦皮質吸至離心管A中，輕輕吹打10次(切記吹打時不可有氣泡產生)，冰中靜置2 min，吸取2 ml上清液至離心管B中，再次加入2 ml種植培養基(90% DMEM-F12+10% FBS)至離心管A中吹打10次，重復3遍，將裝有6 ml上清液的離心管B以1 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液后加入種植培養基，200目鋼篩過濾，輕輕吹打10次制成細胞懸液。臺盼藍拒染試驗，血細胞計數板鏡下計數，以1.0×105～1.0×106個/ml的密度接種于多聚-L-賴氨酸包被過的培養皿中，置37 ℃ 5%CO295%濕度培養箱內培養。4～6 h后，將種植培養基全量換成飼養培養基(97% Neurobasal-A+2% B-27+1% L-谷氨酰胺)維持培養，每隔3 d飼養培養基全量換液。

1.4 免疫熒光[3]染色鑒定神經元 神經元培養第4天后首先用0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌5 min×3次。0.3% Triton X-100孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。5% BSA封閉1 h。孵育NSE多克隆抗體(1∶100，Gibco公司，USA)，4 ℃過夜。室溫復溫5 min，37 ℃恒溫30 min。孵育NSE二抗(1∶100，中杉金橋)，37 ℃ 1 h。0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。DAPI(1∶1 000，Sigma，USA)染細胞核5 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。50%甘油封片。培養板在普通熒光顯微鏡(Olympus，Japan)下檢測。對照實驗只加0.01 mol/L PBS和二抗，細胞均為陰性染色。抗體稀釋液為0.01 mol/L PBS。

1.5 神經元損傷模型的建立 體外應用氧糖剝奪模型，能夠較理想地模擬體內缺血低氧情況。選取培養7 d的神經元，倒去原培養液，用PBS沖洗2遍，加入無糖培養基，置于通入95% N2和5% CO237 ℃的恒溫低氧培養箱中，孵育60 min后，去除無糖培養基，重新加入飼養培養基(97% Neurobasal-A+2% B-27添加劑+1% L-谷氨酰胺)置于37 ℃ 5% CO295%濕度培養箱內培養，分別在培養1、6、12、24、48、72 h時提取神經元蛋白質。

1.6 Western blotting法檢測NSE蛋白表達水平 提取神經元蛋白質后，經10% SDS-PAGE凝膠分離，采用半干法轉膜47 min，然后用5% BSA封閉2 h，加一抗置于搖床上放入4 ℃冰箱內孵育過夜，室溫下搖床上孵育二抗2 h，化學發光，曝光，于凝膠成像系統中采集圖像分析。

2 結果

2.1 神經元的形態學觀察 在倒置顯微鏡下，初次分離種植的海馬神經元呈圓形或橢圓形，胞體透明，體積小，無突起，單個散在分布。培養4～6h，大部分細胞基本貼壁，12h可見部分細胞伸出短小突起，胞體立體感強，發亮。培養1d，突起的長度增加(見圖1A)；培養3d，細胞明顯增多，胞體明顯增大，飽滿，突起明顯增長，多呈雙極、多極突起，相互連接交織成網狀(見圖1B)；培養5～7d，胞體聚集，突起縱橫交錯，增粗、增長，形成神經網絡(見圖1C、D)。

注：圖A、B分別為培養1、3d細胞形態；圖C、D為培養5～7d細胞形態

圖1 大鼠海馬區神經元培養不同時間點形態變化(×200)

Figure1Morphologicalchangesofrathippocampusneuroncellsatdifferenttimepointsduringinvitroculture

2.2 免疫熒光染色鑒定觀察結果 選取培養第4天的細胞(此時細胞形態較為典型，且膠質細胞尚未發育成熟)，免疫熒光染色，以胞質和/或突起染成黃綠色為陽性，整個細胞都不被染色為陰性。在20倍物鏡下隨機選取10個視野范圍內的所有細胞，分別統計陽性細胞數和細胞核數(細胞總數)，計算陽性率(陽性細胞數/細胞核數)，陽性率的平均數代表神經元的純度[4]。經鑒定，神經元細胞核染色清晰，形態典型，突起走形如網狀，陽性率為(93.6±1.6)%，見圖2。

注：A為細胞核藍染，代表細胞總數；B為陽性神經元；C為陰性神經元

圖2 免疫熒光染色計數陽性神經元

Figure 2 Neuron cells of positive immunofluorescence staining

2.3 Western blotting檢測NSE蛋白表達 各組NSE蛋白表達比較，差異有統計學意義(F=500.75，P<0.01)。實驗組損傷后各時間點NSE蛋白表達高于對照組，細胞培養24、48 h NSE蛋白表達均高于細胞培養其他時間點，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖3、4)。

注：NSE=神經元特異性烯醇化酶

圖3 Western blotting檢測不同時間點NSE蛋白表達水平

Figure 3 NSE protein expression levels tested by Western blotting at different time points

注：與對照組比較，aP<0.05

圖4 不同時間點NSE蛋白表達水平比較

Figure 4 Comparison of NSE protein expression level at different time points

3 討論

EBI是指SAH發生后72 h內出現的全腦直接損傷[5]，早期海馬區神經元即可出現凋亡、壞死及數目減少，在SAH患者預后中起重要作用。因此，EBI的研究在SAH患者的治療、預防中具有很大的潛力，能有效減輕SAH造成的損傷，對降低SAH后致殘率和病死率有重要意義[6]。

近年來，許多臨床及實驗研究顯示，NSE僅存在于神經元及神經內分泌細胞的胞質中，正常情況下，血清和腦脊液中NSE的含量極少，然而在腦損傷后，部分神經元壞死、崩解，從而導致神經元細胞膜破壞，NSE可釋放入細胞間隙和腦脊液中，通過血-腦脊液屏障(BBB)進入血液和腦脊液中。因此，NSE在腦損傷中的變化水平目前已成為廣大學者的研究熱點。有報道認為，腦脊液或血液中增高的NSE與神經元損傷的數目有關[7]。本研究通過Western blotting檢測神經元損傷模型中NSE蛋白表達，結果顯示，在神經元損傷后1 h即有NSE低表達，而在6 h時NSE表達明顯增加，且逐漸增多，24～48 h達到高峰，72 h表達逐漸減少，提示建模1 h后神經元即有損傷并逐漸加重，24～48 h最嚴重，與本課題前期體內實驗結果一致，進一步證實神經元損傷后可引起NSE升高，血液中NSE升高及升高的幅度可以反映腦損傷的程度及范圍[8-9]。

有報道認為，腦出血后血腫周圍神經元的死亡形式主要以凋亡為主[10-11]。有研究表明，SAH發生后的整個EBI過程中，同側額葉基底皮質的自體吞噬顯著增加，造成了神經元的損傷，并引起一系列的功能障礙[12]。在SAH發生后，凋亡級聯反應很早就被激活，引起腦水腫、腦血管痙攣、全腦缺血、免疫炎性反應和氧化應激反應等導致廣泛性的細胞凋亡[13]，主要包括BBB、海馬和血管內皮細胞。在中樞神經系統胚胎發育階段中神經元凋亡最早出現，成年個體極少見神經元凋亡，一般多發生在病理情況下[14]。探索細胞凋亡在神經系統疾病中發揮的作用，對揭示神經系統疾病的發生機制及病程的進展有重要意義[15]。本課題前期體內實驗結果發現，實驗組術后6 h即出現大量TUENL染色陽性細胞，24～48 h達到高峰后逐漸下降[16]，這與本實驗中NSE表達的時間趨于一致，提示在腦損傷發生發展過程中，海馬區神經元凋亡發揮了重要的作用，NSE水平升高在一定程度上能夠反映腦損傷的嚴重程度，其機制可能與神經元的凋亡率增高有關。

綜上所述，NSE作為一種簡便易行的生化監測指標，能夠直接反映腦損傷的程度及范圍，監測其水平變化在早期腦損傷患者病情判斷及臨床診療過程中存在一定的參考價值。此外，細胞凋亡對SAH后早期腦損傷的發生、發展有著重要作用，抑制海馬區神經元凋亡是否能夠改善SAH后早期腦損傷患者的預后仍需進一步研究探討。

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(本文編輯：賈萌萌)

Changes of the Expression of Neuron Specific Enolase After the Reoxygenation of Neuron Model Damaged by Oxygen-glucose Deprivation

XUWei-hua，ZHAODong，DAIJing，etal.

MedicalSchoolofShiheziUniversity，Shihezi832000，China

Objective To explore the changes of the expression of neuron specific enolase(NSE)after the reoxygenation of in vitro culture neuron model damaged by oxygen-glucose deprivation.Methods In vitro primary culture was conducted on the neurons in hippocampus area of newborn SD rats within 24 hours.Evaluation of the neurons was carried out by using immunofluorescent staining and electron microscope.By oxygen-glucose deprivation，the damaged neuron model which was ischemic and hypoxic was established.Protein was extracted from the model 1，6，12，24，48 and 72 hours after reoxygenation，and Western blotting method was used to test NSE expression level in the model at different time points.Results On day 4 during in vitro culture，immunofluorescent staining showed clear nuclear staining，typical shape of net with protuberance and deformation and a positive rate of(93.6±1.6)%.The two groups were significantly different in NSE protein expression level(F=500.75，P<0.01).The trial group was higher(P<0.05)than the control group in NSE protein expression at different time points after neuron damage.The NSE protein expression levels at hour 24 and hour 48 during in vitro culture were higher(P<0.05)than those at other time points.Conclusion NSE could be used as an indicator of SAH and EBI，for it could reflect the damage degree of brain tissue.

Subarachnoid hemorrhage；Primary cell culture；Hippocampus；Neurons；Oxygen-glucose deprivation；Neuron specific enolase

國家自然科學基金資助項目(81360185)；新疆生產兵團博士基金資助項目(2011BB016)

832000新疆石河子市，石河子大學醫學院(徐偉華，黃嘯元)；石河子大學醫學院第一附屬醫院神經外科(趙冬，戴晶，劉祺，許暉，王業忠)

王業忠，832000新疆石河子市，石河子大學醫學院第一附屬醫院神經外科；E-mail：wangyz2008@126.com

R 743.35

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.20.020

2015-01-03；

2015-04-20)