燈盞生脈膠囊含藥血清對神經元缺氧復氧損傷的保護作用及機制研究

周子懿，盧鴻基，向 軍，陳依萍，王立新，蔡業峰，蔡定芳

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·中醫·中西醫結合研究·

燈盞生脈膠囊含藥血清對神經元缺氧復氧損傷的保護作用及機制研究

周子懿，盧鴻基，向 軍，陳依萍，王立新，蔡業峰，蔡定芳

目的 從細胞水平探討燈盞生脈膠囊(DZSM)含藥血清對原代大鼠皮質神經元氧糖剝奪/復氧(OGD/R )損傷模型的保護作用及其可能機制。方法 將出生24 h內SD大鼠的皮質神經元原代培養7 d后隨機分為空白對照組、OGD模型組、正常血清對照組、低劑量DZSM組、高劑量DZSM組。空白對照組不進行預處理及造模，其他各組在OGD/R前分別采用0.9%氯化鈉溶液、正常大鼠血清、低劑量DZSM含藥血清、高劑量DZSM含藥血清預處理，在OGD/R后24.0 h用光鏡觀察神經元形態學變化，采用XTT法測定細胞存活率、流式細胞術測定細胞凋亡率、Western blotting測定縫隙連接蛋白43(Cx43)表達量，并觀察OGD/R后0.5、6.0、12.0、24.0 h Cx43表達變化。結果OGD/R后24.0 h，OGD模型組神經元呈現損傷特征，細胞存活率〔(54.6±6.4)%〕較空白對照組(100.0%)降低(P<0.05)，細胞凋亡率升高〔(48.6±4.6)%與(8.8±1.0)%〕(P<0.05)；OGD/R模型組Cx43在OGD/R后0.5 h表達量升高，并持續整個觀察過程(P<0.05)。低、高劑量DZSM組光鏡下可見神經元損傷，較OGD模型組減輕；低劑量DZSM細胞存活率為(69.6±7.7)%，高劑量DZSM細胞存活率為(76.1±8.8)%，均較OGD模型組細胞存活率高(P<0.05)；低劑量DZSM組細胞凋亡率為(25.0±5.9)%，高劑量DZSM組為(18.2±4.9)%，與OGD模型組〔(48.6±9.2)%〕比較，差異有統計學意義(P<0.05)。OGD模型組、正常血清對照組、低劑量DZSM組和高劑量DZSM組Cx43表達量分別為(72.8±6.9)、(63.1±6.6)、 (21.1±3.2)、(24.4±3.8)，低、高劑量DZSM組與OGD模型組相比，Cx43表達均下降(P<0.05)。結論 DZSM含藥血清可抑制OGD/R模型神經元凋亡，提高細胞存活率，其機制可能與抑制Cx43的表達有關。

燈盞生脈膠囊；腦缺血；神經細胞；縫隙連接蛋白43

周子懿，盧鴻基，向軍，等.燈盞生脈膠囊含藥血清對神經元缺氧復氧損傷的保護作用及機制研究[J].中國全科醫學，2015，18(20)：2458-2463.[www.chinagp.net]

Zhou ZY，Lu HJ，Xiang J，et al.Protective effect of drug serum contained in dengzhan shengmai capsule on oxygen and glucose deprivation/reoxygenation injury of nerve cells and its mechanism[J].Chinese General Practice，2015，18(20)：2458-2463.

缺血性腦卒中已成為全球第二大常見死因，每年消耗巨大的醫療資源[1]，臨床正積極尋找有效的治療方案，以降低致殘率、病死率。燈盞生脈膠囊(DZSM)以燈盞細辛為主要成分，配以人參、五味子及麥冬，具有益氣養陰、活血化瘀等功能，已有大型臨床研究證明該藥對缺血性腦卒中有治療作用[2]，然而其機制尚待進一步探討。本研究采用體外細胞培養技術結合中藥血清藥理學方法，利用氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)技術誘導大鼠皮質神經元損傷模型，模擬“腦缺血”狀態，觀察DZSM對神經元凋亡的抑制作用，在離體狀態下驗證該藥對腦缺血的保護作用，并進一步揭示其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級標準健康成年雄性SD大鼠，體質量250～280 g。由復旦大學實驗動物中心提供，并飼養于該實驗動物中心，自由進食、飲水。動物房12 h明暗交替，平均溫度22 ℃，相對濕度30%。按照國際實驗動物使用準則對動物進行操作，減少實驗動物在實驗過程中的痛苦。出生24 h內的SD大鼠由中國科學院上海分院實驗動物中心提供。

1.2 試劑與藥品 主要試劑有neurobasal、B-27添加劑、高糖(20.0 mmol/L) DMEM培養液、低糖(0.5 mmol/L) DMEM培養液、胎牛血清(FBS)、青鏈雙抗溶液、L-谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖劑(PBS)粉末均為Gibco產品，L-多聚賴氨酸、PI、XTT均為Sigma產品。一抗Connexin43抗體為Cell singaling Technology產品。二抗FITC標記抗鼠IgG來自Jackson Immuno Research Laboratories(Inc.West Grove，USA)。兔抗tubulin多克隆抗體為Chem Icon產品。羊抗兔IgG- FITC 來自上海康成生物工程公司。6孔、96孔培養板購自Corning公司。DZSM來自云南生物谷燈盞花藥業有限公司(批準文號：國藥準字20026439)。

1.3 實驗方法

1.3.1 DZSM含藥血清制備 將SD大鼠按完全隨機設計分為3組：空白對照組、低劑量DZSM組、高劑量DZSM組，每組各10只。低劑量DZSM組采用0.36 g/kg(將DZSM顆粒溶于0.9%氯化鈉溶液4 ml中制成)、高劑量組采用0.72 g/kg(將DZSM顆粒溶于0.9%氯化鈉溶液4 ml中制成)[3]〔按不同種屬劑量換算公式：dB=dA×(RB/RA)×(WA/WB)，dA為臨床成人用量，dB為大鼠每日每公斤用量，RA為人類的體型系數100，RB為大鼠的體型系數90，WA、WB為已知動物、欲求動物體質量值〕DZSM溶液灌胃，2次/d，連續7 d；空白對照組給予等容積蒸餾水。于末次給藥后2 h處死，下腔靜脈取血，室溫下靜置1 h，置4 ℃過夜。3 000 r/min離心15 min(離心半徑13 cm)。取上清液，經56 ℃30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾滅菌，-20 ℃保存備用。

1.3.2 混合培養神經元與神經元的原代培養[4]出生24 h內的SD大鼠，無菌條件下取出胎鼠置于培養皿中，斷頭取腦分離出雙側大腦皮質，剝除其表面的腦膜組織，快速剪切皮質組織成1 mm ×1 mm × 1 mm大小，置于含0.125%胰蛋白酶的PBS液中，37 ℃消化15 min，加入含20%FBS的DMEM培養液中，反復吹打成單細胞狀態，利用200目篩過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min(離心半徑13 cm)，棄上清液，接種于0.01% L-多聚賴氨酸包被的培養皿，置37 ℃、5% CO2的培養箱，2 h后可觀察到細胞貼壁，部分神經元有突起長出，繼續予高糖DMEM培養液，此為混合培養神經元；若此后全量換液成神經元培養液(97%neurobasal + 2%B-27添加劑+1%L-谷氨酰胺)則為神經元的原代培養。之后每隔3～5 d換液1次。培養7 d后進行后續實驗。

1.3.3 OGD/R模型的制作[5]OGD/R模型模擬神經元體外缺氧模型：神經元培養至第7天，原培養液全量換成低糖(0.5 mmol/L)DMEM培養液，置于特制缺氧箱內充以99.9%氬氣15 min，最終測氧氣含量低于0.1%，37 ℃培養2 h，然后恢復原培養環境(原培養液，37℃、95%空氣和5% CO2潮濕環境的培養箱)繼續培養。

1.3.4 細胞分組及處理 將培養7 d的神經元隨機分為5組，分別為空白對照組、OGD模型組、正常血清對照組、低劑量DZSM組、高劑量DZSM組。正常血清對照組和低/高劑量DZSM組添加血清終濃度為10%，OGD模型組以等量0.9%氯化鈉溶液替代。隨后移至37 ℃特制缺氧箱內按照1.3.3方法培養2 h后取出，立即全量換為神經元培養液(97% neurobasal + 2% B-27添加劑+1% L-谷氨酰胺為神經元培養，若再次置于原培養環境繼續培養則為混合神經元培養)。隨后置于5%CO2、37 ℃培養箱中復氧，再進行后續檢測實驗。空白對照組則不經任何處理，繼續原有條件培養。

1.3.5 神經元鑒定 β-Ⅲ tubulin免疫熒光：培養7 d的神經元用2%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3遍。每孔加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜。PBS清洗一抗3遍。加入二抗稀釋液，室溫下避光孵育1 h。PBS清洗二抗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 細胞形態學觀察 采用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態學變化。

1.3.7 細胞活性測定與細胞凋亡 采用XTT法[6]測定細胞存活情況。各組神經元在終止培養前每孔加入XTT(最終濃度0.15 g/L)，37 ℃、5% CO2孵育4 h，棄上清液，每孔加二甲基亞砜 200 μl，靜置10 min。在酶標儀570 nm讀取各孔吸光度值(A值)。每組設6個平衡樣。細胞存活率(%)以檢測組A值/空白對照組A值×100%表示。

采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況：收集神經元懸液，1 000 r/min，離心5 min (離心半徑13 cm)，棄上清液，沉淀用70%乙醇懸浮，4 ℃冰箱內固定12 h以上。取固定后的細胞用0.01 mol/L PBS(pH 7.4) 洗2遍并懸浮，加入終濃度為20 mg/L的RNaseA，37 ℃恒浴45 min，再加入PI染液至終濃度為50 mg/L，搖勻后4 ℃避光冷藏1 h，在 FACS 420型流式細胞儀上計數10 000個細胞，測定各期DNA含量并計算凋亡細胞所占比例。實驗重復4次，取平均值。

1.3.8 Western blotting檢測縫隙連接蛋白(Cx)43的表達 將組內每兩皿混合神經元消化后合并為1個樣本，每組各6個樣本。十二烷基磺酸鈉(SDS)直接裂解法提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，15%SDS-PAGE電泳，電轉法轉移到NC膜上，封閉，免疫檢測，電化學發光法(ECL)檢測，暗室曝光，顯影、定影、掃描。用圖像處理系統對條帶灰度進行分析，免疫印跡條帶按面積×灰度計算，計算各組Cx43/GAPDH電泳條帶密度比值并進行判斷。

2 結果

2.1 神經元鑒定和DZSM對OGD/R神經元形態學方面的影響 光鏡下觀察各組神經元形態學變化(見圖1A～1E)。OGD模型組多數神經元胞體破裂呈碎片狀，胞體空泡化，突起斷裂甚至消失，或胞體縮小(見圖1B)。正常血清對照組神經元損傷程度與OGD模型組相似，可見部分胞體空泡化，細胞破裂，突起收縮斷裂甚至消失(見圖1C)。低劑量DZSM組神經元與OGD模型組相比，損傷有所減輕，僅小部分胞體破碎，折光度可(見圖1D)；高劑量DZSM組大部分細胞形態基本正常，胞體有立體感，少量胞體破碎(見圖1E)。采用免疫熒光技術，對體外培養7d的皮質神經元進行鑒定(見圖1F)。

注：A=空白對照組，B=OGD模型組，C=正常血清對照組，D=低劑量DZSM組，E=高劑量DZSM組，F神經元鑒定圖

圖1 倒置相差顯微鏡高倍鏡觀察DZSM含藥血清對OGD/R后24 h神經元形態學的影響(× 200)及神經元鑒定圖

Figure 1 Effects of drug serum of DZSM on the morphological changes of nerve cells at 24 h after OGD/R by the observation through inverted phase contrast microscope and the identification image of neurons

2.2 DZSM含藥血清干預對OGD/R后神經元存活率的影響 各組在OGD/R后24 h收獲細胞進行XTT檢測，OGD/R神經元存活率空白對照組為100.0%，OGD模型組為(54.6 ±6.4)%，正常血清對照組為(55.2±5.8)%，低劑量DZSM組為(69.6 ±7.7)%，高劑量DZSM組為(76.1±8.8)%，各組間差異有統計學意義(F=48.850，P<0.05，見圖2)；其中空白對照組神經元存活率高于其他4組(P<0.05)，低、高劑量DZSM組神經元存活率均高于OGD模型組(P<0.05)，低DZSM劑量組和高DZSM劑量組神經元存活率間差異無統計學意義(P>0.05，見圖2)。

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與OGD模型組比較，bP<0.05

圖2 DZSM含藥血清對OGD/R神經元存活率的影響(n=6)

Figure 2 Effects of DZSM containing serum on neuronal viability after OGD/R

2.3 DZSM含藥血清對OGD/R神經元凋亡率的影響 OGD/R后24 h神經元凋亡率空白對照組為(8.8±1.0)%，OGD模型組為(48.6±4.6)%，正常血清對照組為(48.7±7.8)%，低劑量DZSM組為(25.0±2.9)%，高劑量DZSM組為(18.2±2.5)%，各組間比較差異有統計學意義(F=16.972，P<0.05)；其中空白對照組神經元凋亡率低于其他4組(P<0.05)，低、高劑量DZSM組神經元凋亡率均低于OGD模型組(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.05，見圖3)。

2.4 OGD/R損傷后Cx43的表達變化 收集混合培養的神經元采用Western blotting法檢測Cx43在OGD/R后0.5、6.0、12.0、24.0 h的表達變化。空白對照組及OGD模型組OGD/R后0.5、6.0、12.0、24.0 h 時Cx43的表達量分別為(8.61±1.24)、 (33.06±4.32)、 (30.92±4.10)、(31.47±4.53)、(32.28±4.61)，各組間比較差異有統計學意義(F=6.946，P<0.05)；與空白對照組比較，OGD模型組OGD/R后0.5、6.0、12.0、24.0 h 時Cx43的表達量均升高，差異有統計學意義(P<0.05，見圖4)。

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與OGD模型組比較，bP<0.05

圖3 DZSM含藥血清對OGD/R神經元凋亡率的影響(n=6)

Figure 3 Flow-cytometric analysis of the effects of DZSM containing serum on OGD-induced neuronal apoptosis

注：與空白對照組比較，aP<0.005

圖4 Western blotting法檢測OGD/R后不同時間點Cx43的表達

(n=6)

Figure 4 Cx43 expression levels after OGD/R tested by western blotting method in different times

2.5 DZSM含藥血清對OGD/R后Cx43表達的影響 各組在OGD/R后24.0 h采用Western blotting法分析Cx43的表達水平，空白對照組、OGD模型組、正常血清對照組、低劑量DZSM組和高劑量DZSM組Cx43表達量分別為(22.7±2.4)、(72.8±6.9)、(63.1±6.6)、(21.1±3.2)、(24.4±3.8)，各組間比較差異有統計學意義(F=154.55，P<0.05)；其中OGD模型組、正常血清對照組Cx43表達量均較空白對照組升高，低、高劑量DZSM組Cx43表達量均較與OGD模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，低、高劑量DZSM組Cx43表達量間差異無統計學意義(PP>0.05，見圖5)。

注：與空白對照比較，aP<0.05;與OGD模型組比較，bP<0.05

圖5 Western blot檢測OGD/R后各組Cx43的表達(n=6)

Figure 5 Cx43 expression levels after OGD/R tested by western blotting method in different groups

3 討論

3.1 中藥血清藥理學是研究中藥復方藥理作用的理想方法 中藥血清藥理學以含藥血清代替中藥粗提物作為藥物源加入離體反應系統中，克服了中藥復方在體外研究的不便，是深入研究中藥復方藥理作用的新方法[7]。而離體培養神經元是從細胞水平研究神經元損傷和藥物作用的體外模型，與血清藥理學方法相結合，避免了藥物自身的理化性質對實驗造成的干擾，更客觀地從分子水平闡明藥物作用機制，是目前研究中藥復方制劑效果的理想實驗方案。

3.2 DZSM在體外缺血缺氧模型中具有神經保護作用 DZSM具有益氣養陰、活血通絡的功效，臨床用于氣陰兩虛、瘀阻腦絡型缺血性卒中的治療。國內學者總結了DZSM的腦保護機制可能與其抑制炎性免疫反應、抗氧自由基、抑制鈣超載、緩解血管痙攣，改善微循環，增加血流量從而保護缺血腦組織有關[8]。在此基礎上，本研究利用中藥血清藥理學方法進一步從細胞水平觀察了DZSM含藥血清對OGD/R的神經元活力及凋亡的影響。實驗結果顯示，低劑量DZSM組與高劑量DZSM組原代皮質神經元凋亡率降低，細胞存活率增高，雖然高、低劑量DZSM組間并不存在確切的劑量依賴關系，但高劑量DZSM組皮質神經元凋亡率要低于低劑量DZSM組，表明一定劑量的DZSM具腦保護作用，較大劑量可能取得更好的效果，可以抗缺氧損傷導致的神經元凋亡。這一體外研究結果與李浩等[3]利用大鼠MCAO模型觀察DZSM對腦缺血再灌注損傷的影響一致，提示在細胞水平DZSM同樣能起到保護神經元的作用。

3.3 縫隙連接細胞間通訊(GJIC)在腦缺血損傷機制中起關鍵作用 縫隙連接(GJ)的分子基礎是Cx，其由2個位于相鄰細胞的細胞膜上互相對應的半通道組成[9]，可供分子量小于1.2 kD的小分子低選擇性地在胞間傳遞，這種胞間通訊方式即為GJIC[10-11]。目前，有學者認為缺血再灌注損傷時，與神經元凋亡損傷密切相關的GJ功能會異常增強[9]。缺血的神經元可通過GJ以“鈣波”形式改變周圍細胞內的鈣離子濃度，釋放谷氨酸鹽，使缺血損傷蔓延。如果這種蔓延趨勢不被有效阻止，有害物質、凋亡信號等損傷性因素傳遞至缺血區毗鄰的細胞，會使受損細胞增多，并通過GJ向臨近的半暗帶細胞擴散，使腦梗死區域擴大[12-13]。

Cx家族有許多成員，其中Cx43在中樞神經系統分布最廣泛。Thompson等[9]在體外培養的神經元中發現OGD可導致更多縫隙連接通道開放，導致葡萄糖及ATP的外流，加重缺血損傷。類似地，有學者在模擬缺氧缺血模型的腦片及細胞培養研究中，發現Cx43表達增多，GJ功能異常增強會導致細胞凋亡增加，腦損害加重；采用GJ阻滯劑后，星形膠質細胞Cx43表達減少，缺氧缺血后腦損害減輕[14-15]。有學者用DNA原位末端標記等方法發現新生大鼠腦皮質及海馬缺血缺氧后Cx43表達逐漸增加，其變化規律與神經元凋亡嚴重程度及腦損傷相吻合[16]。可以推測，腦缺血缺氧損傷與Cx43表達及其GJ功能變化有關，在缺氧復氧損傷時，神經元之間可通過GJ傳遞的死亡信號增強細胞凋亡或死亡，抑制GJ功能可對缺氧復氧損傷起到保護作用[17]。本研究在體外神經元培養OGD/R模型中發現，Cx43在OGD復氧后0.5 h表達量開始增高，并一直持續至復氧后的24.0 h，與上述學者離體及體內研究相吻合。低劑量及高劑量DZSM組均能抑制OGD誘導的Cx43增高，這可能與DZSM中一些有效成分可起到抑制Cx43的作用，使得異常增強的GJ功能受到抑制，從而起到神經保護作用。

綜上，本研究提示DZSM含藥血清可抑制OGD/R模型神經元凋亡，提高細胞存活率，并從GJIC的角度探討其保護神經元的可能機制，為神經保護作用提供分子生物學線索和依據。

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(本文編輯：趙躍翠)

Protective Effect of Drug Serum Contained in Dengzhan Shengmai Capsule on Oxygen and Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury of Nerve Cells and Its Mechanism

ZHOUZi-yi，LUHong-ji，XIANGJun，etal.

TheSecondAffiliatedHospital，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510120，China

Objective To investigate the protective effect of drug serum contained in Dengzhan Shengmai (DZSM) capsule on the oxygen and glucose deprivation/reoxygenation injury model of cortical nerve cells of primary rats and its possible mechanism.Methods The primary culture of cortical nerve cells of newborn SD rats within 24 hours was conducted.On day 7 of the culture，the cells were divided into five groups:blank control group，OGD model group，normal serum control group，low-dose DZSM group and high-dose DZSM group.The blank control group was not administrated with any pretreatment and model building，the other four groups were respectively administrated with 0.9% sodium chloride solution infection，the serum of normal rats，low-dose drug serum of DZSM and high-dose drug serum of DZSM before OGD/R.At 24h after OGD/R，morphological changes of the nerve cells were observed by light microscope，cell viability rates were determined by XTT methods，apoptosis rates were determined by flow cytometry，the expression levels of connexin 43 (Cx43) were determined by Western blotting method，and the protein expression changes of Cx43 were observed at 0.5h，6.0h，12.0h and 24.0h after OGD/R.Results At 24.0h after OGD/R，we noted injury characters in the nerve cells of the OGD model group，and the OGD group was lower in cell viability〔(54.6±6.4)% vs.100.0%;P<0.05〕 and higher in apoptosis rate〔(48.6±4.6)% vs.(8.8±1.0)%;P<0.05〕 than the blank control group;the OGD model group had kept an increasing trend (P<0.05) in Cx43 expression 0.5h after OGD/R through the whole observation process.We observed nerve cell injury in low-dose DZSM group and high-dose DZSM group under light microscope，which was slighter than OGD model group;the cell viability rates of low-dose DZSM group and high-dose DZSM group were(69.6±7.7)% and(76.1±8.8)%，both higher (P<0.05) than that of OGD model group;the apoptosis rates of low-dose DZSM group and high-dose DZSM group were (25.0±5.9)% and (18.2±4.9)% respectively，which were significantly different (P<0.05) from that of OGD group，which was(48.6±9.2)%.The expression levels of Cx43 of OGD model group，normal serum control group，low-dose DZSM group and high-dose DZSM group were (72.8±6.9)，(63.1±6.6)，(21.1±3.2) and (24.4±3.8)，with low-dose DZSM group and high-dose DZSM group lower (P<0.05) than OGD group.Conclusion The drug serum contained in DZSM may inhibit the apoptosis of nerve cells after OGD/R，increase the viability rate of cells.The mechanism may be related with the inhibition of Cx43 expression.

Dengzhan shengmai capsule;Brain ischemia;Nerve cells;Connexin 43

國家自然科學基金資助項目(81403214)

510120廣東省廣州市，廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院腦病一科(周子懿，盧鴻基，王立新，蔡業峰)；復旦大學附屬中山醫院，中西醫結合神經病學研究室 (向軍，陳依萍，蔡定芳)

蔡業峰， 510120廣東省廣州市，廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院腦病一科；E-mail：caiyefeng@126.com。蔡定芳，200032上海市，復旦大學附屬中山醫院，中西醫結合神經病學研究室；E-mail： doctorcn@hotmail.com

R 743.31

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.20.024

2015-01-20；

2015-05-10)