氟美松對一次及二次打擊急性肺損傷大鼠糖皮質激素受體m RNA及細胞因子的影響

宋 然，閻錫新，劉 健，劉威威，李榮芹

(1．河北省邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002； 2．河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000；3．河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001； 4．河北省廊坊市人民醫院，河北 廊坊 065000)

氟美松對一次及二次打擊急性肺損傷大鼠糖皮質激素受體m RNA及細胞因子的影響

宋 然1，閻錫新2，劉 健3，劉威威4，李榮芹2

(1．河北省邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002； 2．河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000；3．河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001； 4．河北省廊坊市人民醫院，河北 廊坊 065000)

目的觀察氟美松對一、二次打擊急性肺損傷大鼠糖皮質激素受體及細胞因子的影響。方法將48只雄性SD大鼠隨機分為對照組(NS組)，尾靜脈注射+氣管內滴入0．9%氯化鈉注射液；一次打擊組(HCl組)，氣管內滴入pH為1．8的鹽酸(HCl)2 mL／kg；二次打擊組(LPS+HCl組)，尾靜脈注射脂多糖(LPS)4 mg／kg，4 h后氣管內再滴入pH為1．8的HCl 0．5 mL／kg；對照氟美松干預組(N+D組)；一次打擊干預組(H+D組)、二次打擊干預組(L+H+D組)；氟美松干預組。造模結束后立即腹腔注射氟美松2 mg／kg。結果一、二次打擊組糖皮質激素受體(GR)mRNA均顯著低于對照組，二次打擊組在激素干預前顯著低于干預后水平，一次打擊組在激素干預前后無明顯變化；一、二次打擊組BALF中細胞總數、PMN分類計數、蛋白含量均顯著高于對照組，激素干預后二次打擊組顯著低于干預前水平，一次打擊組在激素干預前后無明顯變化；一、二次打擊組TNF- ，IL-1 ，IL-4，IL-10均顯著高于對照組；二次打擊組TNF- 及IL-1 在激素干預前顯著高于干預后水平，二次打擊組IL-4和IL-10在激素干預前顯著低于干預后水平，一次打擊組在激素干預前后無明顯變化。結論ALI的病理生理過程和致病因素是緊密相連的，糖皮質激素的干預效果和病因是密切相關的，能減輕靜脈注射LPS在氣管內滴入HCl致ALI的肺部炎癥性損傷，但對單純較大量HCl吸入致ALI無明顯改善作用。

急性肺損傷；急性呼吸窘迫綜合征；細胞因子；糖皮質激素；糖皮質激素受體mRNA；鹽酸

急性呼吸窘迫綜合征是多種原因誘發的急性肺損傷綜合征。機體受到創傷、感染、失血、神經疾病等打擊后，若再次受到誤吸等即使很小程度的打擊也很容易引發急性肺損傷／急性呼吸窘迫綜合征(ALI／ARDS)的發生，即是二次打擊理論(two-hit)[1]。本研究中對HCl吸入的一次打擊及靜脈注射脂多糖(LPS)合并鹽酸(HCl)吸入的二次打擊ALI動物模型進行復制應用，分析其肺組織中的糖皮質激素受體(GR)mRNA的表達情況，顯示血清細胞因子白細胞介素（IL）-4，IL-1β，IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平和糖皮質激素干預后對其水平的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物及分組

健康雄性大鼠48只，購自河北醫科大學動物中心，合格證號為1011158，體重250～300 g。標準日糧和無菌飲用水，大鼠飼料購自河北醫科大學動物中心。日照12 h，室溫20～25℃，3 d后用于試驗。將其隨機分為6組，即對照組（NS組）、一次打擊組（HCl組），二次打擊組（LPS+HCl組）、對照干預組（NS+DEX組）、一次打擊干預組（HCl+DEX組）、二次打擊干預組（LPS+HCl+ DEX組），各8只。

1．2 動物模型建立

NS組動物稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，尾靜脈注射0．9%氯化鈉注射液(1．2 mL／kg)，4 h后氣管內滴入0．5 mL／kg。HCl組動物稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下行頸前正中切口，暴露氣管，7號針頭刺入氣管，滴注pH為1．8的HCl(石家莊市試劑廠）2 mL／kg。LPS+HCl組動物稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，尾靜脈注射 LPS(L2880，Sigma公司）4 mg／kg，4 h后行頸前正中切口，暴露氣管，用7號針頭刺入氣管，滴注 pH為1．8的 HCl 0．5 mL／kg。NS+DEX組、HCl+DEX組、LPS+HCl+DEX組為激素干預組。造模結束后立即腹腔注射氯美松（石家莊制藥廠，國藥準字H20052358，規格為2 mg＜以地塞米松磷酸鈉計＞）2 mg／kg。

1．3 標本的收集與處理

各組分別于造模結束后4 h用10%水合氯醛(4 mL／kg)腹腔麻醉，開胸，心臟抽血，處死。

肺組織病理學檢查：右肺下葉用10%中性福爾馬林液固定，切片用HE染色。

肺濕重／干重比值（W／D）測定：將右肺的后葉和副葉輕輕擦干表面，立即稱重，記為濕重（W），然后置80℃干燥箱，48 h后稱重，記為干重（D），計算 W／D。

血清制備：經開胸心臟抽血，處死動物。收集血液，離心(3 000 r／min，4℃，10 min)，吸取上清液，分裝，-80℃保存。

支氣管肺泡灌洗液（BALF）制備：分離出氣管，然后做倒“T”字型切口。經氣管插管行左肺支氣管肺泡灌洗。采用4℃無菌生理鹽水2 mL灌洗左肺：灌洗時將生理鹽水經氣管插管緩慢注入，輕輕按摩胸壁，保留20～30 s后緩慢抽出，反復3次，收集全部BALF，經2層紗布過濾，離心(1 200 r／min，4℃，10 min)，吸取上清液，分裝，-80℃保存。

BALF中細胞計數和中性粒細胞計數：BALF中的細胞沉淀懸浮于200 μL生理鹽水中，取20 μL懸液加入380 μL白細胞稀釋液中，混勻后取出20 μL用計數板常規計數白細胞總數；其余涂片，HE染色，光鏡下計數200個細胞，計算中性粒細胞所占的比例(PMN%)。

BALF中蛋白的測定：用考馬斯亮蘭法測定BALF中蛋白含量，試劑盒購自南京建成生物公司。

血清和BALF中細胞因子的測定：采用雙抗體夾心ABCELISA法測定 TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-10的含量，試劑盒購自上海森雄生物有限公司（進口分裝）。

GRmRNA表達的測定：稱取右肺前葉100 mg，保存于-80℃冰箱。用Trigol法抽取細胞總 RNA，應用紫外分光光度儀測定組織總RNA的純度，再逆轉錄成cDNA，以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下行PCR擴增。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，以β-actin作為內參照。GR引物序列為，上游 5′-AGG GAT TCA GCA AGC CAC-3′，下游 5′CGC CCA CCT AAC ATG TTG-3′，擴增產物長度為210 bp；β-actin引物序列為，上游5′-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3′，下游5′-ACC CTC ATA GAT GGG CAC AG-3′，擴增產物長度為115 bp。 PCR擴增條件為，93℃，2 min→93℃，45 s；60℃，60 s；10個循環→93℃，30 s；60℃，45 s；30個循環。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像分析系統掃描并灰度分析，以產物與β-actin吸光度比值表示GRmRNA的相對含量。

1．4 統計學處理

2 結果

2．1 肺組織病理學變化

HCl組和LPS+HCl組肺體積增大，明顯水腫，肺表面可見點狀出血，光鏡下觀察均可見肺間質及肺泡腔水腫、滲出、出血等病理變化。HCl組以氣道黏膜上皮脫落和肺泡腔水腫液滲出為主。LPS+HCl組以肺泡間隔增寬和炎細胞滲出為主。HCl+DEX組病理變化與HCl組差異不大，LPS+HCl+DEX組的上述病理變化減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理結構

2．2 觀察指標

結果見表1至表5及圖2。

表1 各組BALF中蛋白含量和肺組織 W／D的變化(，n=8)

表1 各組BALF中蛋白含量和肺組織 W／D的變化(，n=8)

注：與NS組比較， P＜0．05， P＜0．01；與HCl組比較， P＜0．05，P＜0．01；與LPS+HCl組比較， P＜0．05， P＜0．01；與NS+DEX組比較， P＜0．05， P＜0．01；與HCl+DEX組比較， P＜0．05， P＜0．01。下表同。

組別NS組HCl組LPS+HCl組NS+DEX組HCl+DEX組LPS+HCl+DEX組蛋白含量(g／L) 0．63±0．22 1．26±0．10 1．10±0．19 0．59±0．27 0．90±0．10 0．96±0．16 W／D 3．93±0．21 4．20±0．19 4．37±0．18 4．12±0．15 4．09±0．26 4．05±0．23

表2 各組BALF中細胞總數和PMN%的變化(，n=8)

表2 各組BALF中細胞總數和PMN%的變化(，n=8)

組別NS組HCl組LPS+HCl組NS+DEX組HCl+DEX組LPS+HCl+DEX組細胞總數(×109) 2．67±0．41 3．74±0．40 4．73±0．62 2．89±0．50 3．92±0．45 4．07±0．34 PMN% 6．25±0．24 20．20±5．18 21．00±8．21 5．75±1．91 19．00±7．17 10．75±4．89

表3 各組血清和BALF中TNF- ，IL-1 的變化(ng／L，，n=8)

表3 各組血清和BALF中TNF- ，IL-1 的變化(ng／L，，n=8)

TNF-組別NS組HCl組LPS+HCl組NS+DEX組HCl+DEX組LPS+HCl+DEX組血清299．75±47．66 524．56±55．86 562．57±53．14 258．53±49．06 480．30±48．51 453．89±35．21 BALF 178．60±37．59 348．01±35．60 362．74±45．05 158．83±49．72 350．36±51．19 277．87±49．61 IL-1（BALF）20．66±5．58 31．46±7．37 47．62±2．75 23．66±11．05 34．85±1．37 36．39±7．16

表4 各組血清和BALF中IL-4，IL-10的變化(ng／L，，n=8)

表4 各組血清和BALF中IL-4，IL-10的變化(ng／L，，n=8)

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表5 各組肺組織GR mRNA表達的變化(，n=8)

表5 各組肺組織GR mRNA表達的變化(，n=8)

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圖2 各組肺組織GR mRNA表達水平

3 討論

隨著對ALI病因及發病機制研究的不斷深入，二次打擊學說指出，機體受到創傷、感染、燒傷等“第一次打擊”，使機體處于中等狀態的全身炎性反應綜合征，若繼續即使是作用細微的感染或肺感染性炎癥刺激（二次打擊）都能觸發炎癥級聯反應，短期內出現ARDS甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)[2]。二次打擊學說的重要意義在于，不但要盡快去除原發操作的打擊，還要盡可能避免導致“二次打擊”的因素，避免病情進一步加重、惡化[3]。故本試驗對HCl吸入的“一次打擊”、靜脈注射LPS+HCl吸入的“二次打擊”ALI動物模型進行復制應用，用于對臨床與胃內容物吸入相關聯的ARDS進行模擬分析。

隨著研究的逐漸深入及失控的炎性反應引發MODS理論的出現，使人們對ALI／ARDS的認識逐漸向對炎癥發生、調控的認識轉變。ALI／ARDS是在機體受到創傷、嚴重感染、休克等打擊后出現的肺水腫和微肺不張（以彌漫性肺泡毛細血管膜損傷導致的）為病理特征的通透性增加綜合征及肺部炎癥，是臨床中常見的呼吸系統危重癥，主要臨床癥狀有呼吸頻數、頑固性低氧血癥、呼吸窘迫，胸部X線片檢查顯示雙肺彌漫性浸潤影，且多數患者后期并發多器官功能衰竭，ALI死亡率仍高達40% ～60%[4]。本研究中對胃酸誤吸的情況采用氣管內滴入HCl的方式進行臨床模擬，采用在體模型，與臨床誤吸后的病理生理情況更加相似。對其進行肺組織光鏡下病理檢查，顯示出毛細血管瘀血、肺透明膜的形成、肺泡腔纖維蛋白和中性粒細胞滲出，肺泡間隔增寬及氣道黏膜上皮細胞脫落等變化，根據ALI／ARDS半定量分析的評分進行評估[4]，已符合ALI／ARDS的相關診斷標準，這時兩組ALI／ARDS模型獲得成功復制。2個模型組BALF中的肺組織 W／D及蛋白水平含量均明顯上升，這證實兩組模型中都存在肺泡毛細血管膜損傷，形成肺水腫，與ALI病理特點相符合。

ALI／ARDS發病機制復雜，但其發生、發展和眾多炎癥介質的綜合作用密切相關。目前，國內外研究證實，ALI／ARDS的發生、發展是 SIRS不斷加劇、持續惡化的動態過程，最終導致MODS[5]。ALI／ARDS是MODS在肺部的表現，SIRS是ALI／ARDS和MODS共同的發病基礎。機體在引發SIRS的同時，也必將發生代償性抗炎反應，釋放內源性抗炎介質，致炎和抗炎這一基本矛盾貫穿整個炎癥過程。細胞因子是炎性反應的生理信使分子，按其在炎性反應中的作用可分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子，其聯合作用復雜，不能通過對單個細胞因子作用認識而預測 ALI／ARDS的發生和結局，同時測定多種細胞因子對于理解 ALI／ARDS的發病機理極其重要[6]。由此，本研究中同時測定不同模型大鼠血清、BALF中多種促炎和抗炎性細胞因子水平，探討 ALI／ARDS致炎和抗炎失衡機制，為臨床防治提供新的策略。研究結果顯示，兩模型組血清和灌洗液中的TNF-α均較對照組升高，提示其參與兩肺損傷模型肺局部和全身炎性反應的發生和發展。SIRS出現失控而發展成MODS病理過程中，肺最易受損傷，肺部炎癥高于全身[7]。故筆者認為，本研究中血清IL-1β不能測得可能和 IL-1β在循環中濃度較低有關。兩模型組BALF中IL-1β濃度明顯高于對照組（P＜0．05），且 LPS+HCl組的升高情況較HCl組更明顯，說明“二次打擊”模型的炎性反應可能會更嚴重，“二次打擊”理論是在“一次打擊”導致SIRS的基礎上引發的ALI。IL-4為多效性細胞因子，促進T輔助細胞向2型T輔助細胞分化，抑制促炎性細胞因子，IL-10為免疫反應中最重要的抗炎性細胞因子，除了具有Th2細胞因子的活性外，也是單核／巨噬細胞促炎性細胞因子合成的失活劑[8]。IL-10能抑制 LPS所激活的NF-κB核轉錄并促進促炎性細胞因子的mRNA降解，此外還能降低TNF受體的表達，并促進TNF受體進入全身循環，故IL-4和IL-10在ALI／ARDS炎性反應的調控中發揮著極其重要的作用[9]。本研究結果顯示，兩模型組血清和BALF中IL-4和IL-10水平均明顯高于正常組。

糖皮質激素具有廣泛的抗炎作用，對于ALI／ARDS發病機制中諸個環節和機體炎性反應的復雜免疫網路均有調節作用，且和其他抗炎藥物相比，療效確切，價格低廉，簡便易行，是機體重要的應激激素和臨床常用的抗炎、抗免疫反應藥物。其雖在臨床治療中有廣泛應用，但個體反應性差異和耐藥性等問題明顯影響臨床應用效果[10]。故本研究中應用氟美松腹腔注射，觀察不同原因的ARDS激素治療效果的異同及潛在機理。糖皮質激素通過細胞內特異性GR介導而發揮各種生物學作用，GR是激素核受體主要成員，處于動態平衡中，GR缺失、數量減少、功能缺陷等均會導致激素抵抗[11]。故本研究中采用 PT-PCR法檢測各組模型肺阻中GRmRNA表達情況，和正常對照組比較，兩組肺損傷模型組GRmRNA水平均明顯降低，提示GRmRNA的下調參與了ALI／ARDS的發病機制。兩模型組經氟美松應用干預后，LPS+HCl組的病理損傷情況有所改善，但HCl組的緩解情況不明顯，這可能與兩模型組的造模方法不同具有一定關系。“二次打擊”模型是先給予LPS誘發SIRS，隨后給予HCl導致ALI，與“二次打擊”不同，“一次打擊”模型是由HCl直接誘發 SIRS，隨后再發展為ALI。同時，HCl模型組的HCl用量較LPS+HCl組更高，而肺泡因HCl而發生的快速直接損傷表現更加明顯。說明不同病因引起的 ALI，應用氟美松進行治療的療效不同機制包括了病理損傷過程的差異性。另外，試驗中行氟美松干預，干預后兩模型組在BALF中的蛋白含量和 W／D均發生明顯改善，提示氟美松可有效改善肺水腫及肺泡血管膜的通透性，然而不論ALI為何種致病因素導致，均不能改善肺泡等結構破壞性的變化。

研究中發現，干預后的GRmRNA較干預前明顯上升，而HCl組的變化無明顯差異，同樣，LPS+HCl組干預后的TNF-α、IL-1β水平明顯降低，HCl組干預后的血清TNF-α水平降低，其他均無明顯變化。臨床中，不同致病因素引起的 SIRS發病機制不盡相同，故其臨床干預對策也具有差異性。本研究中對2種病因引起的ALI進行同一激素治療，其臨床療效不同的主要原因也在于此。研究結果顯示，氟美松可增加兩模型組IL-10的水平，但基本不影響IL-4的含量，這提示抗炎因子IL-10的升高是激素發揮抗炎作用的主要方式。

總之，直接肺損傷誘導的肺內炎性反應多伴有肺實質破壞性改變，肺內炎性反應重，全身反應相對以全身炎癥始發的ALI輕；激素對肺內直接損傷的干預效果差，對SIRS誘發的肺損傷作用較明顯；激素受體GRs表達水平下降在ALI發病中發揮重要作用，但在不同誘因ALI激素作用的差異機制有待進一步探討。

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Influence of Dexamethasone on Cytokines and Glucocorticoid Receptor mRNA with the Discrepancy of Intervening of in ALI Rats Induced by One-Hit and Two-Hit

Song Ran1,Yan Xixin2,Liu Jian3,Liu Weiwei4,Li Rongqin2
(1．Handan First Hospital,Handan,Hebei,China 056002; 2．Hebei Medical University Second Hospital,Hebei,Shijiazhuang,China 050000; 3．Handan Central Hospital,Handan,Hebei,China 056001; 4．Langfang People′s Hospital,Langfang,Hebei,China 065000)

Objective To observe the influence of dexamethasone on cytokines and glucocorticoid receptor mRNA with the discrepancy of intervening of in ALI rats induced by one-hit and two-hit．M ethods 48 male SD rats were randomly divided into 6 groups:control group(NS):0．9% saline was instilled into the trachea and tail vein;one-hit group(HCl):HCl(pH 1．8,2 mL／kg)was instilled into the trachea;two-hit group(LPS+HCl):LPS(4 mg／kg)was injected intravenously via a tail vein,4 hours later,HCl(pH 1．8,0．5 mL／kg)was instilled into the trachea;NS+DEX group;HCl+DEX group;LPS+HCl+DEX group．The groups were intraperitoneal injection with dexamethasone(2 mg／kg)after replicating model．Results In the groups of one-hit and two-hit,the(GR)mRNA was lower than those of the control group(P＜0．01)．Comparing to corresponding model groups,the GRmRNA in LPS+HCl+DEX groups increased(P＜0．05),but not in HCl+DEX groups．In the groups of one-hit and two-hit,the total leukocytes,PMN%,the protein concentration in the BALF and W／D were higher than those of the control group(P＜0．05)．Comparing with the corresponding model groups,these index in LPS+ HCl+DEX groups decreased(P＜0．05),but not in HCl+DEX groups．In the groups of one-hit and two-hit,TNF-α,IL-1β,IL-4, IL-10 both in serum and BALF were higher than those of the control group(P＜0．05)．Comparing to corresponding model groups, TNF-α,IL-1β in LPS+HCl+DEX groups decreased(P＜0．05),IL-4,IL-10 in LPS+HCl+DEX groups increased(P＜0．05),but not in HCl+DEX groups．Conclusion The pulmonary morphology,the permeability,the inflammatory cytokines and the glucocorticoid receptor mRNA in these two models is not consistent．It indicated that pathogenesis of ARDS is different by different risk factors．Dexamethasone can alleviate the pulmonary inflammatory injury caused by“two-hit”,but not useful to ALI caused by HCl．So curative effect of glucocorticoid is associated with clinical reasons．

acute lung injury;acute respiratory distress syndrome;cytokines;glucocorticoids;glucocorticoid receptor mRNA;hydrochloric acid

R965；R977.1+5

A

1006-4931(2015)21-0025-04

2015-03-30；

2015-06-15)

河北省衛生廳科技項目，項目編號：ZL20140129。