食物對大鼠體內(nèi)尼莫地平藥代動力學的影響

楊自豪，劉 嘉，龍遠華，李衛(wèi)平

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400037）

食物對大鼠體內(nèi)尼莫地平藥代動力學的影響

楊自豪，劉 嘉，龍遠華，李衛(wèi)平

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400037）

目的建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法測定大鼠血漿中尼莫地平的質(zhì)量濃度，并研究食物對大鼠體內(nèi)尼莫地平藥代動力學的影響。方法將18只雄性SD大鼠隨機分成3組，分別于空腹、進食標準餐和進食高脂餐后灌胃尼莫地平20 mg／kg，采用HPLC-MS／MS法測定大鼠血漿中尼莫地平濃度，用WinNonlin 6．3軟件計算主要藥代動力學參數(shù)。結果大鼠于空腹、進食標準餐和進食高脂餐后灌胃給予尼莫地平的主要藥代動力學參數(shù)峰濃度(Cmax)分別為（19．19±4．76）ng／mL，（30．14±7．91）ng／mL，（34．39± 8．03）ng／mL，達峰時間(Tmax)分別為0．96 h，0．79 h和0．75 h，藥時曲線下面積(AUCinf)分別為（94．47±17．24）ng／（mL·h），（139．6± 32．9）ng／（mL·h），（148．1±34．2）ng／（mL·h）；大鼠進食后給藥的藥代動力學參數(shù)與空腹相比，均有顯著性差異（P＜0．05），而標準餐組和高脂餐組間的差異無統(tǒng)計學意義。結論進食可顯著提高尼莫地平在大鼠體內(nèi)的吸收速度和程度。

尼莫地平；藥代動力學；大鼠；食物；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

尼莫地平為1，4-二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，可有效解除血管痙攣，并可減輕由于大量Ca2+內(nèi)流造成的神經(jīng)細胞損害，臨床已廣泛應用于缺血性腦卒中的治療[1]。近年來的研究表明，尼莫地平還具有治療腦室出血[2]、改善腦卒中后血管性認知功能障礙[3]、治療慢性腦供血不足[4]、預防神經(jīng)毒性[5]等作用。食物可通過影響胃腸道的生理狀態(tài)而改變藥物的藥代動力學特征[6-8]，如改變胃腸道的pH、延遲胃排空及刺激膽汁分泌等。Cho等[9]研究了黃芩素對尼莫地平在大鼠體內(nèi)的藥代動力學影響，周虹等[10]研究了磷酸川芎嗪對尼莫地平在大鼠體內(nèi)的藥代動力學影響，吳淳等[11]研究了天然冰片對尼莫地平在大鼠體內(nèi)的藥代動力學影響，而有關食物對尼莫地平藥代動力學影響的研究尚未見文獻報道。由于食物對很多藥物的吸收速度和程度均有較顯著的影響，作為需長期服用的藥物，研究食物對尼莫地平藥代動力學的影響，可為臨床合理用藥指導提供參考。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與動物

API 3000型三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Applied Biosystem-Sciex公司）；Shimadzu LC-20AD型液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）；Vortex-Genie 2型多功能旋渦混合器（美國Scientific Industries公司）；HGC-36A型氮吹儀（上海泉島科貿(mào)有限公司）；ATSrese 1620型超純水機（重慶市安特生環(huán)保設備有限公司）。尼莫地平對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量以99．2%計，批號為100270-200002）；尼莫地平原料藥（鄭州天耀科技有限公司，含量以99．0%計，批號為 20141001）；甲酸（Dikma Technologies Inc．）、甲醇（Sigma-Aldrich Co．）均為色譜純；乙醚（天津市恒興化學試劑制造有限公司）、正己烷（深圳市吉田化工有限公司）均為分析純；水為去離子水。清潔級雄性SD大鼠18只，體重(250±50)g，6～8周齡，購自成都達碩生物科技有限公司，動物許可證號為SCXK(川)2013-24，研究經(jīng)第三軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會批準。

1．2 方法

1．2．1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Shiseido Capcell PAK C18MGII柱（50 mm×2．0 mm，5 μm），保護柱為Security Guard Cartridge C18柱(Phenomenex，4 mm× 3．0 mm)；流動相：A為0．3%甲酸水溶液，B為甲醇，0．01～1．00 min時B 20%→85%，1．01～2．50 min時B 85%，2．51～4．00 min時B 20%；流速：0．8 mL／min；分流：40%進入MS，60%進入廢液；柱溫：25℃；進樣量：10 μL；單個樣品分析時間：4．00 min。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正離子MRM模式監(jiān)測，離子噴射電壓4 500 V，離子源溫度425℃，尼莫地平監(jiān)測離子 m／z 419．4→301．3（碰撞能量20 eV），非洛地平（內(nèi)標）監(jiān)測離子 m／z 384．2→338．1（碰撞能量25 eV）。

1．2．2 溶液配制和質(zhì)控樣品制備

取尼莫地平對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度為1．003 mg／mL的貯備液。再用甲醇將貯備液稀釋，分別得質(zhì)量濃度為4．012，10．03，100．3，200．6，501．6，802．4，1 003 ng／mL的尼莫地平工作溶液。內(nèi)標非洛地平用甲醇配制并稀釋成質(zhì)量濃度為201．2 ng／mL的工作溶液。將上述溶液分裝后貯存于4℃冰箱備用。

將 6份來自不同大鼠的空白血漿混合，分別取 5 μL標準曲線或質(zhì)控樣品工作液，加入100 μL混合空白血漿中，配成尼莫地平的系列質(zhì)量濃度含藥血漿，質(zhì)量濃度分別為 0．200 6，0．501 5，5．015，10．03，25．08，40．12，50．15 ng／mL，血漿隨行質(zhì)控樣品中尼莫地平的低、中、高質(zhì)量濃度分別為0．501 5，10．03，40．12 ng／mL，最低定量限(LLOQ)質(zhì)控樣品中尼莫地平的質(zhì)量濃度為0．200 6 ng／mL。

1．2．3 血漿樣品處理

精密移取室溫下融化的大鼠血漿100 μL，置 EP管中，加入5 μL甲醇，混勻后加入內(nèi)標工作溶液5μL，渦旋30 s，加入0．1mol／L氫氧化鈉水溶液10 μL，渦旋30 s后加入1 mL萃取劑（乙醚∶正己烷=4∶1），渦旋振蕩混合3 min，12 000 r／min離心5 min，吸取上清液，于30℃下氮氣吹干，殘渣加入50 μL流動相復溶，渦旋混合后離心，吸取上清液入進樣分析。記錄尼莫地平峰面積與內(nèi)標峰面積，代入標準曲線中以計算藥物的血藥濃度。

1．2．4 大鼠體內(nèi)藥代動力學影響試驗

將雄性SD大鼠18只隨機分為3組，空腹組禁食12 h，標準餐組給予普通飼料，高脂餐組給予高脂飼料[12]，均自由飲水。第2天早上8:00灌胃給予尼莫地平原料藥20 mg／kg，分別于給藥前（0 h）及給藥后0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，3，4，6，8 h通過留置針自尾靜脈取血250 μL，取血后補充等體積的生理鹽水。取得的全血置肝素化試管中，12 000 r／min離心5 min分離血漿，-20℃保存待測。將測得的血藥濃度 -時間數(shù)據(jù)采用 Phoenix WinNonlin (version 6．3，Pharsight Corp，Mountain View，CA，USA)軟件按照非房室模型進行處理，計算藥代動力學參數(shù)。采用 SPSS 19．0軟件對達峰時間(Tmax)行 Wilcoxon秩和檢驗，峰濃度(Cmax)、藥時曲線下面積(AUClast及 AUCinf)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后行配對 t檢驗。

2 結果

2．1 專屬性

按擬訂的色譜條件，將處理后的空白血漿、空白血漿+尼莫地平、空白血漿 +內(nèi)標（非洛地平）進樣，色譜圖見圖1。結果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響尼莫地平和內(nèi)標的分離、測定，血漿中尼莫地平和內(nèi)標的保留時間分別約為2．06 min和1．94 min。2．2 線性范圍與最低定量限

圖1 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖

按照1．2．2和1．2．3項下方法制備并測定血漿標準曲線，以尼莫地平血漿樣品的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（Aanalyte／AIS，R）為縱坐標，以尼莫地平血藥濃度(C)為橫坐標，權重系數(shù)1／X2，進行線性回歸，得回歸方程 R=0．012 1 C+0．009 8，r=0．998 7。尼莫地平質(zhì)量濃度線性范圍為0．200 6～50．15 ng／mL，最低定量限為0．200 6 ng／mL。

2．3 準確度與精密度

按照1．2．2和1．2．3項下方法制備并測定低、中、高3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，連續(xù)3 d測定，計算準確度和日內(nèi)、日間精密度，結果見表1。

表1 大鼠血漿中尼莫地平測定準確度、日內(nèi)和日間精密度、萃取回收率

2．4 基質(zhì)效應及萃取回收率

分別取尼莫地平低質(zhì)量濃度質(zhì)控工作溶液5 μL與內(nèi)標溶液5 μL加入40 μL流動相復溶溶劑混合，記作Set 1；選擇6種不同來源的血漿樣品，分別用尼莫地平低質(zhì)量濃度質(zhì)控工作溶液5 μL和內(nèi)標溶液5 μL制備未萃取樣品，得到Set 2。按提取后加入法公式，絕對基質(zhì)效應（MF）=待測物或內(nèi)標在Set 2和Set 1中峰面積比值；內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應因子=待測物與內(nèi)標的MF比值；相對基質(zhì)效應 =內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應因子的變異系數(shù)（CV）[13]。計算得到低質(zhì)量濃度尼莫地平的 MF為（104．25±8．34）%（n= 6）；內(nèi)標的MF為（92．74±4．24）%（n=6）；內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應因子為（95．63±9．47）%(n=6)，相對基質(zhì)效應為8．43%，小于15%，符合歐洲藥物管理局(EMEA)指導原則的要求。

取低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（n=6），按照 1．2．2和1．2．3項下方法制備萃取后樣品并測定，以尼莫地平峰面積與相同質(zhì)量濃度未經(jīng)萃取測定的峰面積平均值之比計算萃取回收率。結果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品具有較一致的萃取回收率，符合國家食品藥品監(jiān)督管理局的《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則》的規(guī)定。

2．5 穩(wěn)定性考察

取低、中、高3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（n=5），置下列試驗條件下進行長期穩(wěn)定性(-20℃凍存14 d)、室溫穩(wěn)定性(室溫下放置6 h)、凍融穩(wěn)定性(-20℃和室溫下反復凍、融3次，每次間隔12 h)、處理后樣品穩(wěn)定性[將處理好的樣品置自動進樣器（4℃）放置12 h]考察。樣品分別經(jīng)上述條件放置一定時間后后，按照1．2．2和1．2．3項下方法制備并測定，以測定值與理論值相比。結果表明，樣品在-20℃下可穩(wěn)定貯存14 d，室溫下可以穩(wěn)定放置6 h，可耐受3次凍融循環(huán)，處理后樣品4℃下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．6 藥代動力學研究

18只SD大鼠按照2．4項下方法進行給藥、采集血樣、測定及數(shù)據(jù)處理，得到3組大鼠灌胃給予尼莫地平20 mg／kg后平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。可見，空腹情況下尼莫地平的血藥濃度較兩種餐后更低，而進食標準餐和進食高脂餐后的尼莫地平濃度-時間曲線無明顯差異。各組相關的主要藥代動力學參數(shù)見表2?？梢?，尼莫地平在SD大鼠體內(nèi)吸收迅速，各組均在1 h內(nèi)達血藥濃度峰值。與空腹給藥組相比，在標準餐和高脂餐后服用尼莫地平 Cmax和 AUCinf均顯著升高（P＜0．05），其中 Cmax分別升高57．06%和79．21%，AUCinf分別升高47．78%和56．77%，提示進食可增加尼莫地平的吸收程度。Wilcoxon秩和檢驗結果顯示，餐后服用尼莫地平的 Tmax值與空腹組比較具有顯著性差異（P＜0．05），提示進食可增加尼莫地平的吸收速度。然而，標準餐組和高脂餐組的藥代動力學參數(shù)無顯著性差異（P＞0．05），說明食物的類型對尼莫地平的吸收無顯著性影響。

圖2 不同情況下大鼠灌胃給予尼莫地平20 mg／kg后平均血藥濃度-時間曲線（n=6）

表2 不同情況下大鼠灌胃給予尼莫地平20 mg／kg后的藥代動力學參數(shù)（n=6，）

表2 不同情況下大鼠灌胃給予尼莫地平20 mg／kg后的藥代動力學參數(shù)（n=6，）

參數(shù)Tmax(h) Cmax(ng／mL) AUClast[ng／(mL·h)] AUCinf[ng／(mL·h)]半衰期(t1／2，h)z(L／h)平均駐留時間(MRT，h)空腹組0．96(0．75-1) 19．19±4．76 88．38±17．31 94．47±17．24 1．02±0．28 40．9±18．2 1．15±0．29標準餐組0．79(0．5-1) 30．14±7．91 137．5±29．4 139．6±32．9 1．08±0．25 35．3±16．7 1．21±0．31高脂餐組0．75(0．5-1) 34．39±8．03 146．4±32．7 148．1±34．2 1．11±0．32 38．7±21．3 1．29±0．46

3 討論

本試驗中建立了HPLC-MS／MS法，對大鼠血漿樣品進行定量測定，能專屬、靈敏、快速地測得大鼠體內(nèi)尼莫地平質(zhì)量濃度。相較于已有尼莫地平大鼠血漿的測定方法[9-11]，所建立的方法具有更低的檢測限，檢測結果更可靠，更能滿足尼莫地平在SD大鼠體內(nèi)血藥濃度的測定及藥代動力學研究的要求。且本研究首次探討了食物以及不同食物類型對尼莫地平體內(nèi)藥代動力學的影響，可為其臨床合理使用提供參考。

為能更明顯地觀察到食物引起尼莫地平吸收速度和程度的差異，本研究中選擇的大鼠給藥劑量為20 mg／kg，即人體臨床等效劑量的2倍進行試驗[14]。且在整個試驗過程中，大鼠并未出現(xiàn)不良反應及死亡現(xiàn)象，表明該劑量在大鼠可耐受范圍內(nèi)。

本研究結果顯示，食物可增加尼莫地平吸收的速度和程度。尼莫地平具較高的親脂性[15]，而飲食可刺激膽汁分泌與排出，膽汁酸可增加尼莫地平的溶解度，且加快血液及淋巴液流速，從而促進機體對尼莫地平的吸收[16]；且進食后胃排空速度明顯減慢，增加尼莫地平的胃滯留時間，使尼莫地平快速崩解、溶出，從而達峰時間提前且血藥濃度增加，因此食物有利于尼莫地平吸收。本研究結果表明，標準餐組和高脂餐組的藥代動力學參數(shù)無顯著性差異，說明食物類型對尼莫地平的吸收無顯著性影響，即該藥服用時食物類型的選擇具較好的兼容性。

本研究中的尼莫地平在大鼠空腹條件下口服體內(nèi)藥代動力學結果與吳淳等[11]的研究結果基本一致，而與周虹等[10]的研究結果差異較大。結合尼莫地平在 Beagle犬以及人體內(nèi)[17-19]的藥代動力學參數(shù)進行等效劑量換算，提示尼莫地平的藥代動力學可能存在較大的個體差異，臨床研究時應增大樣本量進行試驗。

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Food Effect on Pharmacokinetics of Nimodipine in Rats

Yang Zihao,Liu Jia,Long Yuanhua,Li Weiping
(The Second Affiliated Hospital of Third Military Medical University,Chongqing,China 400037)

Objective To develop an HPLC-MS／MS method for the determination of nimodipine in rat plasma,and to study the food effect on pharmacokinetics of nimodipine in rats．M ethods 18 male SD rats were randomly divided into 3 groups,and were gavaged with nimodipine at a dose of 20 mg／kg under fasting conditions,with a standard meal or with a high-fat meal．The concentrations of nimodipinein rat plasma wereanalyzed with HPLC-MS／MS system,and WinNonlin 6．3 softwarewasutilized toperform the pharmacokinetic parameters calculation．Results The mean Cmax,Tmaxand AUCinfwere(19．19±4．76),(30．14±7．91)and(34．39± 8．03)ng／mL,0．96,0．79 and 0．75 h,(94．47±17．24),(139．6±32．9)and(148．1±34．2)ng／(mL· h)under fasting conditions, with a standard meal or with a high-fat meal in rats．Administered with food showed influence on the pharmacokinetics of nimodipine, with Cmax,Tmaxand AUCinfsignificantly increased compared with fasting group(P＜0．05),but no significant differences were found between the standard meal and high-fat meal group．Conclusion Administered with food can increase the rate and extent of nimodipine absorption in rats．

nimodipne;pharmacokinetics;rat;food;HPLC-MS／MS

R965；R972+.4

A

1006-4931(2015)21-0071-04

楊自豪，大學本科，藥師，主要從事藥品庫管工作，(電話)023-68755400；李衛(wèi)平，碩士研究生，主管藥師，主要從事藥品采購工作，本文通訊作者，（電子信箱）howe215＠qq．com。

2015-03-18)