LC-MS法同時(shí)測(cè)定至靈菌絲膠囊中5種成分的含量*

張先林，戴國(guó)梁，丁 康，貢 濤，陳志遠(yuǎn)，居文政**

江蘇省中醫(yī)院1藥學(xué)部，2臨床藥理科，南京 210029；3南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210029

LC-MS法同時(shí)測(cè)定至靈菌絲膠囊中5種成分的含量*

張先林1，戴國(guó)梁2，丁 康3，貢 濤3，陳志遠(yuǎn)1，居文政2**

江蘇省中醫(yī)院1藥學(xué)部，2臨床藥理科，南京 210029；3南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210029

目的：建立同時(shí)測(cè)定至靈菌絲膠囊中腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤含量的方法。方法：采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）法。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸溶液，采用電噴霧電離源，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），用于定量分析的5種成分檢測(cè)離子對(duì)m/z分別為268.1/136、244.2/112.1、284.1/152.1、183.1/69、136.1/119.1。外標(biāo)法定量分析。結(jié)果：5種成分的質(zhì)量濃度分別在37.5～1200、20～640、40～1280、77.5～2480、27.5～880 ng·mL-1范圍內(nèi)與各自的峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9985、0.9964、0.9991、0.993、0.9924）。加樣回收率在95.7%～101.4%范圍內(nèi)，RSD均低于7.3%。結(jié)論：該法專屬性強(qiáng)、快速靈敏，可用于至靈菌絲膠囊中5種成分的含量測(cè)定。

至靈菌絲膠囊；腺苷；胞苷；鳥(niǎo)苷；甘露醇；腺嘌呤；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草，是由子座（草部分）與菌核（蟲(chóng)的尸體部分）組成的復(fù)合體[1]，具有緩解腦溢血和腦血栓、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、降血糖、抗衰老等[2-3]多種功效。蛹蟲(chóng)草含有腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤等成分[4-5]，且容易人工栽培[6-7]，因此蛹蟲(chóng)草目前被選為冬蟲(chóng)夏草的最佳替代品。

至靈菌絲膠囊主要成分為蛹蟲(chóng)草，該制劑主要具有補(bǔ)腎養(yǎng)肺、固精益氣、增強(qiáng)免疫力之功效。本研究旨在建立一種選擇性好、快速簡(jiǎn)便的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定至靈菌絲膠囊中5種成分的質(zhì)量濃度，為控制至靈菌絲膠囊的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

至靈菌絲膠囊（江蘇省中醫(yī)院，批號(hào)：1312004、1401002、130203）。標(biāo)準(zhǔn)品：腺苷（批號(hào)：13081813，純度：99.2%）、胞苷（批號(hào)：13062509，純度：98.9%）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)：13091006，純度：99.3%）、甘露醇（批號(hào)：13110812，純度：99.5%）、腺嘌呤（批號(hào)：13120812，純度：99.2%），均為成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀（含Agilent 6430 LC-MS三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI），MassHunter色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司）；AE240電子天平 （上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（5∶95，v/ v）；流速：200 μL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2 μL；自動(dòng)進(jìn)樣方式。離子化模式：正離子；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400℃。確定化合物母離子后，在SIM模式下，對(duì)化合物的碎裂電壓（Fragmentor）進(jìn)行優(yōu)化；母離子發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的離子碎片。在Product Ion模式下，對(duì)化合物母離子施加一定量的碰撞能量（CE），得到其相應(yīng)的離子碎片，最后在分段多反映離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，優(yōu)化目標(biāo)物離子最佳碰撞能量。腺苷的Fragmentor及CE值分別為100V、20V；胞苷的Fragmentor及CE值分別為100V、10 V；鳥(niǎo)苷的Fragmentor及CE值分別為90V、10 V；甘露醇的Fragmentor及CE值分別為70V、10 V；腺嘌呤的Fragmentor及CE值分別為100 V、30 V；檢測(cè)對(duì)象：腺苷m/z 268.1→m/z 136；胞苷m/z 244.2→m/z 112.1；鳥(niǎo)苷m/z 284.1→m/z 152.1；甘露醇m/z 183.1→m/z 69；腺嘌呤m/z 136.1→m/z 119.1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別取腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解并定容，制成5種成分的質(zhì)量濃度分別為1200、640、1280、2480、880 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液。依次進(jìn)行倍比稀釋，外標(biāo)法定量分析。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種成分對(duì)照品LC-MS/MS分析濃度信息/ng·mL-1

2.2.2 供試品溶液 取符合膠囊制劑要求的至靈菌絲膠囊內(nèi)容物，混勻，精密稱定0.5 g，置50 mL量瓶中，用90%甲醇溶解并定容，超聲處理30 min（功率：45 kHz），搖勻，濾過(guò)。精密吸取續(xù)濾液1 mL，置5 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)圖1。

圖1 液-質(zhì)聯(lián)用MRM離子流圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液各2 μL，按照“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤的質(zhì)量濃度在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表2 至靈菌絲膠囊中5種成分的線性回歸結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

取低、中、高3個(gè)濃度（選取HB5、HB4、HB2）的混合對(duì)照品分別重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量2 μL，按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷的RSD分別為2.3%、2.7%、3.5%（n=5）；胞苷的RSD分別為1.2%、3.4%、5.1%（n=5）；鳥(niǎo)苷的RSD分別為2.5%、2.6%、3.1%（n=5）；甘露醇的RSD分別為3.5%、1.2%、1.9%（n=5）；腺嘌呤的RSD分別為4.2%、4.3%、3.9%（n=5）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：1312004）5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置于進(jìn)樣室中，分別放置0、4、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤峰面積的 RSD分別為 1.6%、4.3%、3.8%、2.2%、2.9%（n=5），結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性均較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：1312004）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤峰面積的RSD分別為1.2%、1.4%、1.6%、2.1%、1.4%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品 （批號(hào)：1312004）約0.25 g各3份，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果加樣回收率在95.7%～101.4%，RSD均低于7.3%。

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批至靈菌絲膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣2 μL，并按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算各批膠囊中腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 至靈菌絲膠囊中5種成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）/μg·g-1

3 討 論

本研究前期曾采用高效液相色譜法（HPLC法）檢測(cè)至靈菌絲膠囊中的成分，但各成分相互干擾嚴(yán)重，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，多成分含量同時(shí)測(cè)定色譜條件摸索困難等問(wèn)題。

通過(guò)對(duì)不同規(guī)格的色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱所得色譜峰保留時(shí)間適中，峰形較好。試驗(yàn)中分別嘗試采用正、負(fù)2種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效率明顯高于負(fù)離子模式。同時(shí)，考察了流動(dòng)相的組成與比例對(duì)分析結(jié)果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)甲醇與0.1%甲酸水溶液的比例為5∶95時(shí)，5種成分分離良好，彼此不會(huì)相互影響，且均在4 min內(nèi)出峰。

《中國(guó)藥典》2010版中載有蛹蟲(chóng)草的制劑（金水寶膠囊、金水寶片），僅采用HPLC法測(cè)定其中腺苷的含量，而本研究采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定至靈菌絲膠囊中腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，該方法具有干擾少、分析時(shí)間短、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，為科學(xué)控制至靈菌絲膠囊質(zhì)量提供了可靠而簡(jiǎn)捷的方法。

[1] 鄭婷婷，李多偉，王英娟，等.蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及有效成份含量分析[J].菌物研究，2004，2（4）：22-4.

[2] 凌建亞，孫迎節(jié)，呂 鵬，等.蟲(chóng)草屬真菌中蟲(chóng)草素的超聲波提取及其毛細(xì)管電泳測(cè)定 [J].菌物系統(tǒng)，2002，21（3）：394-7.

[3] 夏春雨，孫 巍，劉學(xué)銘.蟲(chóng)草有效成分的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食用菌，2009，28（2）：3-6.

[4] 貢成良，吳友良，朱軍貞，等.家蠶蛹蟲(chóng)草的人工培育及其成分分析[J].中國(guó)食用菌，1989，12（4）：21-4.

[5] 劉靜明，鐘裕容，楊 智，等.蛹蟲(chóng)草化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，1989，14（10）：32-6.

[6] 張紅霞，吳 畏，陳 偉，等.北冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素和腺苷含量的HPLC分析[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，21（4）：53-7.

[7] 王 瑩，鐵 梅，康平利，等.ICP-MS等三種測(cè)定蛹蟲(chóng)草硒含量方法的比較 [J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29（3）：815-8.

Simultaneous Determination of Five Components in Zhiling Junsi Capsules by LC-MS*

ZHANG Xian-lin1,DAI Guo-liang2,DING Kang3,GONG Tao3,CHEN Zhi-yuan1,JU Wen-zheng2**
1Department of Pharmacy,2Department of Clinical Pharmacology,the Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine(TCM),Nanjing 210029;3First School of Clinical Medicine,Nanjing University of TCM,Nanjing 210029

Objective:To develop an LC-MS method for the determination of adenosine,cytidine, guanosine,mannitol and adenine in Zhiling Junsi capsules.Methods:Isocratic elution was carried out with mobile phase consisting of methanol-0.1%formic acid.The separation was performed on Agilent Zorbax SB-C18column,and the mass spectrometer was operated in the positive electrospray ionization (ESI)mode using multiple reaction monitoring(MRM)for the analysis of five components.The precursor to product ionm/ztransitions monitored for adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine were 268.1/136,244.2/ 112.1,284.1/152.1,183.1/69 and 136.1/119.1,respectively.An external standard method was used for quantitation.Results:Adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine were all analyzed exactly,the linear ranges were 37.5-1200,20-640,40-1280,77.5-2480 and 27.5-880 ng·mL-1,respectively.The linear coefficients were 0.9985,0.9964,0.9991,0.9935 and 0.9924,respectively.The recoveries of the five analytes ranged from 95.7%to 101.4%and the relative standard deviations were all within 7.3%.Conclusions:A sensitive,accuracy and suitable LC-MS method has been developed,and the method can be applied for the determination of adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine in Zhiling Junsi capsules.

Zhiling Junsi Capsule;Adenosine;Cytidine;Guanosine;Mannitol;Adenine;LC-MS

R927.2

A

1673-7806（2015）06-543-03

科技部重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng) （No.2012ZX-09303009-002）；江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才（LJ200906）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（ysxk-2010）

張先林，男，本科，副主任中藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)E-mail:CL19890525@126.com

**通訊作者居文政，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥臨床藥代動(dòng)力學(xué) E-mail:wzhju333@163.com

2015-08-26

2015-11-09