微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚用于大鼠巨大創面修復的研究

湯永喆　何奇　亓發芝

(1.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院乳腺外科，上海　200030；

2.復旦大學附屬中山醫院整形外科，上海　200032)

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微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚用于大鼠巨大創面修復的研究

湯永喆1何奇1亓發芝2

(1.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院乳腺外科，上海200030；

2.復旦大學附屬中山醫院整形外科，上海200032)

摘要目的：評價微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚用于修復大鼠背部巨大創面的效果。方法： 選取32只8周齡SD大鼠，制備鼠背巨大創面模型，并隨機分為空白對照組(A組)、人工真皮組(B組)、微粒皮組(C組)及組織工程皮膚組(D組)。B、C、D組大鼠分別以打孔拉網的人工真皮、自體原位微粒皮移植物、自體原位微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚移植物修復創面，A組創面僅覆蓋油紗布。觀察術后第1、3、5周時的創面愈合情況；通過CK15及CD29免疫組織化學染色法觀察表皮干細胞(epidermal stem cells, ESCs)在創面愈合過程中的作用；對鼠背組織切片進行HE染色、Masson染色后鏡下觀察，并結合掃描電鏡下觀察，了解創面真皮層的愈合質量。結果：D組大鼠背部創面的修復效果最佳，術后第5周時創面已基本愈合。免疫組織化學染色結果顯示，D組大鼠ESCs逐漸向表皮層遷移并參與創面的愈合；D組真皮層的厚度大于其余3組(P<0.01)，D組真皮層膠原纖維排列致密整齊。結論：微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚用于創面修復的效果優于微粒皮及人工真皮。

關鍵詞微粒皮；組織工程皮膚；修復

如何修復因手術切除體表良惡性腫瘤、體表皮膚撕脫、大面積的Ⅱ度及Ⅲ度燒傷或燙傷等所致的大面積皮膚缺損的創面，一直是外科修復研究的重要課題。微粒皮移植術所需設備簡單、操作容易，故在臨床廣泛應用。但是，由于真皮基質的不足，微粒皮移植術后創面修復區域易出現色素沉著、破潰、瘢痕增生，甚至因表皮攣縮而出現關節活動受限、肢體功能障礙等現象。近年來發現，具有多向分化能力的皮膚干細胞能夠通過定向誘導分化而形成毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器細胞，具有廣闊的應用前景[1]。本研究擬通過改良微粒皮移植的方法，以微粒皮基底層內的表皮干細胞(epidermal stem cells，ESCs)和毛囊隆突部位的毛囊干細胞(hair follicle stem cells，FSCs)作為自體種子細胞的來源，并以脫細胞人工真皮作為支架材料，復合構建一種組織工程皮膚，期盼即刻修復創面及提高創面修復的質量。

1資料與方法

1.1一般資料與及分組取8周齡SD大鼠32只(中國科學院上海分院實驗動物中心提供)，雌雄不拘，體質量200～250 g，單籠飼養，將其隨機分為空白對照組(A組)、人工真皮組(B組)、微粒皮組(C組)及組織工程皮膚組(D組)。

1.2試劑與儀器小鼠抗大鼠CK15單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗大鼠integrin beta-1(CD29)單克隆抗體(美國Epitomics公司)；顯微解剖器械、游標卡尺(中國上海精密儀器儀表廠)；Atrauman油紗布(德國Hartmann公司)；S-520型掃描電鏡(日本Hitachi公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；HCP-2型臨界點干燥儀(日本Hitachi公司)；IB-3型離子濺射儀(日本EIKO公司)。

1.3實驗方法

1.3.1皮膚巨大創面模型的建立SD大鼠背部備皮后，于鼠背部正中制備直徑約30 mm的圓形全層創面，深至肉膜層，創面內放置限制框，以限制皮膚收縮。

1.3.2自體原位微粒皮的制備采用稱質量法稱取制備創面時切取的鼠背皮膚的1/10，將其反削成0.4 mm中厚皮，以鋒利小剪刀反復修剪，使最終微粒皮成品的最大顆粒小于1 mm×1 mm，備用。

1.3.3修復材料覆蓋創面A組大鼠的創面僅覆蓋與創面等大的油紗布；B組大鼠的創面覆蓋打孔拉網的人工真皮后，外覆與創面等大的油紗布；C組大鼠的創面均勻涂抹自體原位微粒皮移植物后，外覆與創面等大的油紗布；D組大鼠的創面覆蓋自體原位微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚移植物后，外覆與創面等大的油紗布。各組創面覆蓋內層移植物后均以6-0尼龍線打包縫合、加壓固定。

1.3.4修復效果觀察術后第1、3、5周時觀察創面愈合情況，測量創面愈合面積，并計算創面愈合率。創面愈合率(%)=創面愈合面積/創面總面積×100%。術后第1、3、5周時分別取全層創面及相鄰創緣的部分正常皮膚1塊。將所取組織以10%甲醛溶液固定24 h，然后用石蠟包埋后切片；對切片行CK15及CD29免疫組織化學染色，觀察ESCs在創面愈合過程中的作用；行HE染色及Masson染色，觀察創面真皮層膠原纖維的密度、排列及結構。術后第5周時，各組隨機取1只SD大鼠，于鼠背部創面正中定位，自長軸最遠端向創面中心方向切取包含創緣正常皮膚的創面全層約2 mm×5 mm的長方體組織塊，制作掃描電鏡樣本，通過掃描電鏡了解各組創面真皮層厚度及修復效果。

2結果

2.1各組大鼠術后創面的大體觀察結果術后第1周時，A、B兩組創面裸露，僅可見新鮮肉芽組織生長；C組創面微粒皮連接成片，已覆蓋大部分創面；D組創面有上皮島形成，周圍有新鮮肉芽組織生長；見圖1。術后第3周時，各組大鼠的限制框逐漸脫落，創面均明顯收縮，A組創面收縮最明顯；B組創面收縮受到人工真皮移植物的限制，未見有明顯的表皮覆蓋；C組創面可見菲薄的新生皮膚覆蓋；D組創面新生皮膚與正常皮膚相連接。術后第5周時，B組創面明顯收縮，呈直線形，其余3組創面大小無明顯變化；C組創面的外觀更接近正常皮膚的質地，但愈合創面未見毛發生長；D組新生皮膚覆蓋面積更大，可見陳舊血痂邊緣剝離，痂下可見新生皮膚覆蓋創面；見圖2。

A：空白對照組(A組)；B：人工真皮組(B組)；C：微粒皮組(C組)；D：組織工程皮膚組(D組)

A：空白對照組(A組)；B：人工真皮組(B組)；C：微粒皮組(C組)；D：組織工程皮膚組(D組)

組別n術后第1周術后第3周術后第5周A組818.54±2.5372.46±3.6186.02±1.57B組821.23±4.1453.82±5.51*81.23±2.54C組867.31±6.33#80.74±3.6891.02±2.01D組842.23±8.21#△71.03±4.4784.20±3.15

注：與A、B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與其他3組比較，*P<0.05

2.3ESCs的分布和遷移CK15及CD29免疫組織化學染色結果有一定的一致性。術后第1周時，各組創面的新生表皮中均可見CK15及CD29陽性的ESCs分布。CK15及CD29陽性細胞主要分布在棘層和顆粒層，并集中在部分區域呈高表達；同時，CD29陽性細胞在表皮基底層及新生腺體中也有一定的分布。C、D組中CK15及CD29陽性細胞在創面全層均勻分布，皮膚的毛囊處也可見CK15及CD29高表達。修復過程中，CK15及CD29陽性細胞逐漸向表層遷移，且它們在包括表皮及毛囊在內的創面全層的分布均有不同程度的減少。見圖3。

A：CK15陽性細胞在毛囊處高表達，且陽性細胞帶與表皮基底相連續；B：毛囊向表皮聚集，參與創面修復，毛囊處的CD29陽性細胞帶接續表皮基底，CD29在新生腺體結構中呈陽性表達

圖3術后第3周時組織工程皮膚組(D組)

鼠背創面的免疫組織化學染色結果(×200)

2.4真皮層修復效果的評價HE染色結果顯示，術后第1周時，4組創面的真皮層中即有淋巴細胞及中性粒細胞的全層浸潤，并有散在分布的小血管；淋巴細胞及中性粒細胞的浸潤在術后第3周及第5周逐漸減少；小血管的分布密度在術后第3周時增高，而在術后第5周時下降。C、D組在術后第3周時已可見完整連續的表皮基底膜。Masson染色結果顯示，4組真皮中均可見表皮下方膠原重構；B、D組中，自體新生的膠原在愈合過程中逐漸取代人工真皮支架結構，且其排列從松散凌亂趨于整齊；C、D組中的成纖維細胞分布較A、B組更為密集。見圖4。

A：微粒皮結構和毛囊結構明顯向表皮遷移，并與表皮融合；B：人工真皮結構基本已被自體新生膠原所替代，真皮層成纖維細胞分布密集，膠原排列整齊

圖4術后第5周時組織工程皮膚組(D組)鼠背創面

HE染色(A)和Masson染色(B)結果(×200)

術后第5周時，取各組鼠背創面的組織切片，在掃描電鏡下隨機測量3處真皮層的厚度并計算平均值，A、B、C、D組真皮層厚度分別為(235.53±14.34)μm、(518.79±29.86)μm、(123.35±8.41)μm、(768.15±24.22)μm，D組真皮層厚度大于其余3組，B組真皮層厚度大于A、C組，差異均有統計學意義(P<0.01)。

掃描電鏡下觀察發現，各組創面真皮層中均未見典型的乳頭層和網狀層結構及層次形成。C組的真皮層內有較多的膠原沉積，膠原纖維結構粗糙，表現為疏松而粗大的網狀層結構，膠原束間呈現纖維交叉聯系；B、D組的人工真皮支架結構中可見排列整齊的膠原纖維及血管長入，形成一層致密的真皮樣結締組織；B組創面表皮結構基本形成，但其下缺乏基底膜及乳頭層結構支持，故有所脫落；D組真皮層結構致密，與其上層表皮銜接穩定。見圖5。

A：人工真皮組(B組)創面表皮結構基本形成，但其下缺乏基底膜及乳頭層結構支持；B：微粒皮組(C組)真皮層內有較多的膠原沉積，膠原纖維結構粗糙，表現為疏松而粗大的網狀層結構，膠原束間呈現纖維交叉聯系；C：組織工程皮膚組(D組)表皮覆蓋完整，與其下真皮層銜接穩定，真皮層重建為較為成熟的層次和結構

圖53組術后第5周時創面真皮層的掃描電鏡照片(×50)

3討論

組織工程皮膚對于改善創面愈合環境、提高創面修復質量，作用非常明顯。本研究用于修復創面的微粒皮除含有表皮、真皮等基本結構外，還含有血管、毛囊等皮膚附屬器結構。這些皮膚附屬器結構可提供多種作為種子細胞的皮膚干細胞，包括基底層內的ESCs和毛囊隆突部位的FSCs，故微粒皮的移植是一種復合移植。創面修復過程中，ESCs被誘導后可向表皮細胞分化；毛囊隆突部位的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)表達升高，表皮生長因子誘導FSCs向上遷移，參與表皮的形成，并阻止FSCs向毛發分化[2]。

嚙齒類動物的皮膚在創面修復的過程中表現出強烈的收縮特性。本實驗初期，為了減少創面收縮對實驗的干擾，在大鼠背部創面內放置限制框并嚴格打包，起到了良好的限制作用。然而，實驗后期在限制框脫落后，可觀察到4組大鼠的創面明顯收縮。B組中，人工真皮移植物的物理結構起到了限制創面收縮的作用，但同時也影響了創面的愈合速度；D組中，組織工程皮膚移植物對創面的覆蓋彌補了創面愈合速度的缺陷，并限制了創面收縮，保證了創面的愈合質量。

本研究采用CK15和CD29對皮膚干細胞進行雙重標記，以了解皮膚干細胞在表皮愈合中的作用。CK15(cytokeratin 15)是一種角蛋白，是構成表皮細胞骨架結構的主要成分。毛囊隆突部的FSCs表達CK15，且CK15的表達量會在干細胞的分化過程中率先減少，提示CK15可能對于ESCs的鑒別有一定意義[3]。Piwko-Czuchra等[4]研究發現CD29高表達的細胞貼壁速度快，增殖能力強，對基底膜的形成頗為重要。本研究中免疫組織化學染色結果顯示，CK15陽性細胞和CD29陽性細胞的分布具有一致性；CK15陽性細胞及CD29陽性細胞在皮膚創傷初期主要分布在表皮的棘層和顆粒層(CD29在表皮基底也呈陽性高表達)，CK15和CD29在創面中的毛囊分布區也有高表達。制備微粒皮的過程中，機械切割使ESCs在全層均勻地散在分布。在創面愈合過程中，CK15陽性細胞及CD29陽性細胞呈現出逐漸向表皮遷移的趨勢，可以觀察到毛囊的陽性細胞帶在修復過程中與表皮基底銜接融合。術后第5周時，CK15陽性細胞及CD29陽性細胞在創面全層、表皮及毛囊等的分布均有不同程度減少。以上提示，初期創面可能缺乏足夠的表皮生長因子等細胞因子，后期創緣反應性分泌的細胞因子啟動了創面修復，促進了ESCs與FSCs的分化，使得各組創面的陽性細胞均有消耗減少；而D組在創面修復過程中，細胞因子不僅來源于創緣的反應性分泌，同時來源于人工支架內長入的成纖維細胞，誘導ESCs向表皮分化，保證創面的表皮覆蓋。

皮膚創面修復時，創面真皮層的厚度和膠原排列情況反映了真皮層的愈合質量；創面真皮層，有一定的厚度，有利于減少創面收縮，膠原纖維的整齊排列則有利于提高皮膚的耐磨程度，血管的形成和淋巴細胞的浸潤則有助于改善創面微環境[5]。HE染色顯示，大鼠背部創面的愈合過程中，成纖維細胞和微血管不斷遷入人工真皮支架的空間結構內。掃描電鏡下觀察及Masson染色結果則提示，人工真皮支架為新生膠原的排列提供了空間，隨著支架結構內膠原纖維新生重塑，支架結構逐漸降解，在人工真皮殘存結構內可觀察到平行排列、致密有序的膠原束形成，這些膠原束最終與微粒皮完全融合而修復創面，保證了真皮層的厚度。本研究中，在第5周時，D組大鼠的創面真皮層厚度達(768.15±24.22)μm；創面真皮層上方為微粒皮膠原直接覆蓋，表現為排列紊亂的粗大波形的膠原結構，膠原間的空隙較大；創面真皮層下方為長入人工真皮支架結構中平行排列的膠原束及部分殘存支架結構，膠原纖維之間空隙較小，致密有序，兩層之間有過渡。創面的微觀結構體現了組織工程皮膚組的真皮層修復效果具有明顯的優勢。

綜上所述，微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚用于大鼠背部巨大創面的修復，愈合質量較好。鑒于大鼠與人類皮膚的收縮特性差異較大，微粒皮復合人工真皮構建的組織工程皮膚能否在臨床應用中達到與動物實驗相近的效果，尚待深入探討。

參考文獻

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[4]Piwko-Czuchra A,Koegel H,Meyer H,et al.Beta1 integrin-mediated adhesion signalling is essential for epidermal progenitor cell expansion[J]PLoS One,2009,4(5):e5488.

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Tissue Engineering Skin Made of Microskin Combined with Artificial Dermis in the Application of Huge Wound Healing in Rats

TANGYongzhe1HEQi1QiFazhi2

1.DepartmentofBreastSurgery,InternationalPeaceMaternityandChildHealthHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200030,China；2.DepartmentofPlasticSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To evaluate the effect of tissue engineering skin(TES), which was made of microskin combined with artificial dermis, in the healing of huge wound on the back of SD rats. Methods:The models of huge wound on the back were made from the selected 32 SD rats at 8 weeks old. They were randomly divided into blank control group (Group A), artificial dermis group (Group B), microskin group (Group C) and TES group (Group D). The wounds in Group B, Group C and Group D were healed by artificial dermis with punching net, in-situ microskin autografts, the TES made of autogenous in-situ microskin combined with artificial dermis, respectively. The wounds in Group A were covered with vaseline gauze. The situations of wound healing at the 1st, 3rd and 5th week after operation were observed.The effects of ESCs during the wound healing process were observed by the CK15 and CD29 immunohistochemical staining.The healing quality of dermis on wound was evaluated by HE staining and Masson staining of tissue biopsies of the back of rats and observation under scanning electronic microscopy. Results: The best healing effect was in Group D and the wounds were almost healed at the 5th week after grafting. The results of immunohistochemical staining showed that ESCs of rats in Group D had moved to the epidermal layer gradually and took part in the wound healing. The thickness of dermal layer in Group D was larger than that in the other 3 groups(P<0.01) and the collagen fibers in dermal layer were arranged compactly and neatly in Group D. Conclusions: The effect of the TES made of microskin combined with artificial dermis in the application of wound healing is superior to that of microskin and artificial dermis.

Key WordsMicroskin；Tissue engineering skin；Healing

中圖分類號R 622

文獻標識碼A

通訊作者何奇，E-mail：drheqi@hotmail.com

基本項目：國家863課題資助項目(編號：2014AA020705)

·論著·