黃芩素靶向p38 MAPK通路抗肺纖維化的作用機制研究

顧文菊邱波（湖北省黃石市第五醫院普內科黃石435005）

黃芩素靶向p38 MAPK通路抗肺纖維化的作用機制研究

顧文菊邱波
（湖北省黃石市第五醫院普內科黃石435005）

摘要：目的：探討黃芩素（baicalein）抗肺纖維化（PF）的療效，并通過測定p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化程度，探討其可能的作用機制。方法：6周齡健康SD雄性大鼠96只，隨機分為正常對照組（C組）、肺纖維化模型組（M組）、p38 MAPK抑制劑SB 203580組（S組）和黃芩素組（B組），每組24只。造模或治療后利用ELISA法檢測血漿中促炎細胞因子高遷移率族蛋白B1 （HMGB1）及細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子1（CINC-1）的水平；比色法測定肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性；Real-time PCR法觀察結腸組織p38及p-p38基因表達水平。結果：M組大鼠血漿HMGB1、CINC-1均明顯升高（P＜0.01），肺組織MPO活性升高（P＜0.01），p38磷酸化程度顯著升高（P＜0.05）；與M組比較，S組和B組大鼠血漿HMGB1、CINC-1均明顯降低（P＜0.01），肺組織MPO活性下降（P＜0.01），p38磷酸化程度顯著下調（P＜0.05）。結論：黃芩素減輕博來霉素（BLM）誘導的大鼠肺纖維化，其作用機制可能與抑制p38 MAPK信號通路有關。

關鍵詞：肺纖維化；黃芩素；靶向p38 MAPK通路；作用機制

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一種病因不明的慢性肺部疾病，屬于肺間質纖維化的一種[1]，主要表現為纖維結締組織在肺泡間隔彌漫增生引起肺組織結構毀損、順應性減低、彌散功能障礙，最終導致呼吸衰竭[2~3]。肺纖維化的發病機理不明，也缺乏有效治療，因此研究肺纖維化的發生、發展規律以及探討新的有效防治手段是目前基礎和臨床關注的熱點。本文對黃芩素（baicalein）治療PF做了初步探討，現報道如下：

1　材料和方法

1.1動物及分組6周齡健康SD雄性大鼠96只，購自河南大學實驗動物中心，所有操作程序獲得河

南大學醫學倫理委員會批準。實驗前禁食不禁水12 h，隨機分為正常對照組（C組）、肺纖維化模型組（M組）、p38 MAPK抑制劑SB 203580組（S組）和黃芩素組（B組），每組24例。

1.2模型制備及處理參照李玉花等[4]的方法，M組以BLM制備PF模型，即大鼠乙醚吸入麻醉，操作臺仰臥位固定，頸部消毒，切開頸部皮膚，逐層剝離，暴露氣管，用一次性1 ml注射器抽取0.2~0.3 ml博萊霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg體重），向氣管內注入，注射后立即將大鼠直立并左右旋轉，使藥液在肺內均勻分布，縫合皮膚，手術過程嚴格無菌操作。C組給予等體積生理鹽水，S組和B組模型分別在BLM造模后第1天開始前連續腹腔注射SB 203580、黃芩素。

1.3方法

1.3.1 ELISA法檢測血漿HMGB1、CINC-1水平采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）進行血漿促炎細胞因子高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子1（CINC-1）水平測定，嚴格按照說明書操作。

1.3.2比色法測定肺組織MPO活性準確稱量各待檢大鼠肺組織，用0.9%生理鹽水按1∶9制成10%勻漿，勻漿液直接分為兩部分：一部分根據Bradford's方法，用蛋白定量分析試劑盒測上清液中蛋白濃度；另一部分用市售MPO檢測試劑盒，按照說明書操作對肺臟組織中MPO活性進行檢測。

1.3.3 Real-time PCR法檢測p38、p-p38 MAPK mRNA表達留取部分肺組織立即投入液氮。從組織中提取總RNA：將整個胃組織剪碎，放入2 ml試管內，用Trizle法提取RNA；用分光光度法測定所提取RNA的濃度；RNA電泳檢測其完整性（1%瓊脂糖凝膠）；mRNA反轉錄：嚴格按照反轉錄試劑盒操作；PCR檢測：采用primer premier 5.0設計p38、p-p38 MAPK及GAPDH基因引物序列，將每個cDNA樣品2 L進行實時熒光定量PCR擴增，每個標本做復孔檢測。用FTC 3000系統軟件進行數據采集、分析。根據標準曲線計算各樣本mRNA拷貝數，p38、p-p38 MAPK mRNA的相對表達量分別用p38、p-p38 MAPK mRNA拷貝數與GAPDH mRNA拷貝數的比值表示。

1.4統計學處理所有數據采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1血漿HMGB1、CINC-1水平改變M組的HMGB1和CINC-1水平與C組比較明顯升高，差異均具有顯著意義（P＜0.01），S組和B組HMGB1、CINC-1水平均比M組明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1　血漿HMGB1、CINC-1水平改變（%，x±s）

2.2肺組織MPO活性變化與C組比較，M組大鼠MPO活性明顯升高，而SB 203580和黃芩素處理可明顯降低M組大鼠肺組織MPO活性。見表2。

表2　肺組織MPO活性改變

2.3p38、p-p38 mRNA表達的改變p38和p-p38基因表達情況，M組p-p38/p38比值較對照組明顯升高（P＜0.05），而SB 203580和黃芩素處理組較M組顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3　p38、p-p38 mRNA表達的改變（%，x±s）

3　討論

PF加重期病情進展快，發生呼吸衰竭和死亡的風險明顯升高，目前尚無特效療法。慢性炎癥是纖維化的早期階段，因此控制炎癥可有效阻斷纖維化進程。隨著全世界對天然藥物的開發越來越重視，從天然產物中尋找安全、有效、低毒的活性成分已經成為抗肺纖維化藥物研發的新方向。黃芩是一味具有抑炎、抗菌、抗病毒、抗氧化作用的中藥，黃芩素和黃芩苷是其主要組成及活性成分，其中以黃芩苷的含量最高，其次是黃芩素，而黃芩苷通過在體內代謝轉化成黃芩素發揮作用。研究[5]發現，黃芩總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化具有明顯的干預作用，為了進一步探索黃芩素的抗纖維化作用。本研究觀察了黃芩素對博萊霉素致大鼠肺纖維化的治療作用，發現黃芩素明顯降低大鼠血漿HMGB1、CINC-1水平、肺組織MPO活性變化。

多條信號通路參與了對炎癥反應的調節，其中p38 MAPK信號通路發揮了非常重要的調控作用。P38 MAPK信號通路激活后，促使下游IL-1、IL-6、TNF-琢等炎癥介質基因表達上調、炎癥因子釋放，導致炎癥反應[6]；同時促進細胞間黏附分子、趨化分子的表達上調[7]。本研究發現，M組大鼠肺組織p38磷酸化程度明顯升高，說明肺纖維化時p38 MAPK被激活，應用其特異性抑制劑明顯抑制p38激活，并降低大鼠血漿HMGB1、CINC-1水平、肺組織MPO活性；黃芩素在降低大鼠血漿HMGB1、CINC-1水平、肺組織MPO活性的同時抑制p38 MAPK激活。綜上所述，黃芩素對肺纖維化大鼠具有保護作用，其機制可能與阻斷p38MAPK通路有關

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參考文獻

[1]Katzenstein AL,Myers JL.Idiopathic pulmonary fibrosis:clinical relevance of pathologic classification[J].Am J Respir Crit Care Med, 1998,157(4 Pt 1):1301-1315

[2]Prasse A,Holle JU,Muller-Quernheim J,et al.Pulmonary fibrosis[J]. Internist (Berl),2010,51(1):6-13

[3]Kuwano K.Involvement of epithelial cell apoptosis in interstitial lung diseases[J].Intern Med,2008,47(5):345-353

[4]李玉花,許先榮,潘慶,等.大黃素對肺纖維化大鼠TGF-茁1及smad3/7信號通路的影響[J].中華中醫藥學刊,2010,28(2):346-347

[5]馬榮林,王尉平,蔣小崗,等.黃芩總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預作用[J].中國藥理學通報,2011,27(4):537-542

[6]Feng YJ,Li YY.The role of p 38 mitogen-activated protein kinase in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J].J Dig Dis,2011,12 (5):327-332

[7]Scaldaferri F,Sans M,Vetrano S,et al.The role of MAPK in governing lymphocyte adhesion to and migration across the microvasculature in inflammatory bowel disease[J].Eur J Immunol,2009,39(1):290-300

收稿日期：（2015-03-23）

中圖分類號：R563

文獻標識碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.08.009