二氫丹參酮對(duì)人肺癌GLC-82細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制研究Δ

孫 蓓，葉因濤，王 冬，錢鈞強(qiáng)，婁建石（.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060；2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070）

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病死率居各種腫瘤的首位,對(duì)人類健康和生命構(gòu)成了極大的威脅。丹參是臨床最常用的活血化瘀中藥，二氫丹參酮（DTS）是丹參的脂溶性活性成分之一，具有菲醌結(jié)構(gòu)，通過(guò)引起DNA損傷從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成[1-2]。近年來(lái)的研究證實(shí)，DTS不僅具有天然抗氧化、抗心血管及抗菌消炎的藥理作用,而且還具有明顯的抗腫瘤活性，尤其是體外抗腫瘤活性，而對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性卻很小[3-5]。目前對(duì)于DTS 誘導(dǎo)人肺癌GLC-82 細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。故筆者擬通過(guò)研究DTS 對(duì)人肺腺癌GLC-82 細(xì)胞的抑制作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為研發(fā)新型防治肺癌的藥物制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo 371 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Electron 公司）；Cyto FLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）；MODEL 680 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；CP225D 電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

DTS 粉末（上海源葉生物公司，批號(hào)：YY90060，純度：＞98%）；青霉素-鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1400，規(guī)格：青霉素10 ku/ml、鏈霉素10 mg/ml）；RPMI1640 培養(yǎng)液（北京百諾克醫(yī)藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；MTT（上海生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京百諾克醫(yī)藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；Annexin Ⅴ-FITC/溴化丙啶（PI）雙染凋亡試劑盒，Bcl-2、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3（Caspase-3）和β-actin抗體（美國(guó)BD公司）。

1.3 細(xì)胞

人肺腺癌GLC-82 細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所免疫室提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的肺癌GLC-82 細(xì)胞液，立即投入37 ℃溫水浴中復(fù)蘇，使細(xì)胞凍存液在1～2 min 內(nèi)融化。細(xì)胞凍存液清洗后，用RPMI1640 培養(yǎng)液（含10%新生牛血清及青霉素-鏈霉素混合液）培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 藥物處理

用DMSO溶解DTS，制備成DTS質(zhì)量濃度為1 mg/ml的母液，超聲10 min 助溶，用培養(yǎng)液稀釋至DMSO 終濃度＜0.1%（VDMSO/VDTS＜0.1μl/ml），過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存，備用。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104ml－1，接種于96 孔板中，每孔200μl。分別設(shè)立空白對(duì)照組和給藥組，空白對(duì)照組給予等體積的培養(yǎng)液，給藥組分別加入不同質(zhì)量濃度（5、10、20、40、80、100 μg/ml）的DTS。分別培養(yǎng)12、24、48 h后，電鏡（×200 倍）下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。加入5 mg/ml 的MTT液繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后吸棄上清，加入DMSO（150μl/孔），振蕩5 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD570）。計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率：細(xì)胞存活率（%）＝（給藥組OD570/空白對(duì)照組OD570）×100%，細(xì)胞抑制率（%）＝1－細(xì)胞存活率（%）；并擬合求得半數(shù)抑制濃度（IC50）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105ml－1，接種于6孔板中，每孔2 ml。分別設(shè)空白對(duì)照組、給藥組，空白對(duì)照組給予等體積的PBS，給藥組使DTS 質(zhì)量濃度為17.85μg/ml（IC20值）。培養(yǎng)12、24、48 h 后以離心半徑為5 cm、1 000 r/min 離心5 min，收集沉淀，PBS 洗2 次；加入5μl Annexin Ⅴ-FITC，4 ℃避光染色5 min，再加入PI 避光染色15 min，然后補(bǔ)足緩沖液至500μl；用300目的細(xì)胞篩過(guò)濾，取濾液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡率。光源采用488 nm 波長(zhǎng)的氫離子激光器，發(fā)射波長(zhǎng)大于630 nm，每份標(biāo)本收集10 000個(gè)細(xì)胞以上，死細(xì)胞著染產(chǎn)生紅色熒光。

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

細(xì)胞分組及給藥情況同“2.4”項(xiàng)下。DTS（17.85μg/ml）分別作用于細(xì)胞12、24、48 h后，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，定量后取等量樣本行SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜在封閉液中封閉2 h，分別與Bcl-2、Bax和Caspase-3（稀釋比例為1 ∶300）的一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，PBS分別洗膜，加入二抗（稀釋比例為1∶3 000），室溫孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光染色液，轉(zhuǎn)入X 光暗盒中曝光3 min，顯影。β-actin為內(nèi)參對(duì)照，以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 DTS對(duì)細(xì)胞活性的影響

MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，給予不同質(zhì)量濃度的DTS 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。DTS 作用24、48 h 后最大細(xì)胞抑制率分別為54.48%、64.21%，IC50值分別為62.36、33.94 μg/ml，且DTS 對(duì)細(xì)胞的抑制作用具有濃度-時(shí)間依賴性。與空白對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞抑制率均升高（P＜0.01或P＜0.05），DTS 對(duì)細(xì)胞的抑制結(jié)果詳見(jiàn)表1。隨著DTS（17.85μg/ml）作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮、脫落死亡，見(jiàn)圖1。

表1 DTS作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響（，n＝3）Tab 1 Effects of DTS on the activity of cell after different duration（，n＝3）

表1 DTS作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響（，n＝3）Tab 1 Effects of DTS on the activity of cell after different duration（，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖1 DTS作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）A.空白對(duì)照組；B.12 h；C.24 h；D.48 hFig 1 Effects of DTS on the morphology of cell after different duration（×200）A.blank control group；B.12 h；C.24 h；D.48 h

3.2 DTS對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

DTS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并隨給藥時(shí)間的增加，誘導(dǎo)凋亡的作用增強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較，DTS 作用12、24、48 h 后細(xì)胞的凋亡率升高（P＜0.01 或P＜0.05）。在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限A3顯示活細(xì)胞，右下象限A4顯示早期凋亡細(xì)胞，右上象限A2顯示晚期凋亡細(xì)胞。散點(diǎn)圖顯示，隨著給藥時(shí)間的增加，左下象限A3 活細(xì)胞逐步減少，而右下象限早期凋亡以及右上象限晚期凋亡細(xì)胞逐步增加。DTS作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)表2，流式散點(diǎn)圖見(jiàn)圖2。

表2 DTS作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of DTS on the apoptosis of cell after different duration（，n＝3）

表2 DTS作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of DTS on the apoptosis of cell after different duration（，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.3 DTS對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，DTS 作用后Bcl-2 蛋白表達(dá)減弱、Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01或P＜0.05）；Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。DTS作用不同時(shí)間對(duì)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)結(jié)果的影響見(jiàn)圖3、表3。

4 討論

丹參中的水溶性和脂溶性成分均具有廣泛且復(fù)雜的藥理作用。在丹參的脂溶性菲醌類成分中，DTS 是主要的抗腫瘤活性成分之一。筆者前期試驗(yàn)研究表明，丹參酮化合物可抑制乳腺癌、宮頸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期分布[6]。

圖2 DTS作用不同時(shí)間后的流式散點(diǎn)圖Fig 2 The flow scatter diagram of DTS effect after different duration

圖3 DTS作用不同時(shí)間后相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)圖譜Fig 3 The expression patterns of Bcl-2，Bax，Caspase-3 protein by DTS after different duration

表3 DTS作用不同時(shí)間對(duì)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）Tab 3 Effects of DTS on the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3 protein after different duration（，n＝3）

表3 DTS作用不同時(shí)間對(duì)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）Tab 3 Effects of DTS on the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3 protein after different duration（，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡（PCD），是在內(nèi)、外因素誘導(dǎo)下，由多基因參與調(diào)控的主動(dòng)的細(xì)胞死亡[7-8]。Bcl-2 家族主要包括抑制凋亡的成員如Bcl-2、Bcl-xL、Bax 等。有研究表明，P53、Bcl-2、c-myc、fas 等基因是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的調(diào)控位點(diǎn)[9-11]。其中，Bcl-2基因是Bcl-2家族中最重要的基因，可抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)一個(gè)啟動(dòng)型Caspase-2 也控制著線粒體通透性的增加和促凋亡因子的釋放[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DTS能明顯抑制人肺腺癌GLC-82 細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間-濃度依賴性。DTS（17.85μg/ml）隨給藥時(shí)間的增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用逐漸增強(qiáng)。隨給藥時(shí)間的變化，DTS能顯著下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。

綜上所述，DTS 能抑制人肺腺癌GLC-82 細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)、上調(diào)Caspase-3 蛋白表達(dá)，激活Caspase 家族蛋白發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用，但其確切的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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