柚皮苷脂質體凝膠的處方制備工藝及質量控制研究

王海燕，梁利香，李 娟，陳月華，陳 瓊（信陽農林學院生物技術系，河南信陽 464000）

柚皮苷又名柚苷、柑橘苷、異橙皮苷，全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎補、枳實、枳殼、化橘紅等中藥的主要有效成分之一[1]。現代藥理研究表明，柚皮苷具有多種生物學活性和藥理作用，包括抗炎[2-3]、抗過敏[4-5]等作用。脂質體是由磷脂雙分子定向排列而成的直徑幾納米至幾微米的超細粒子，雙分子層內外分別包封脂溶性和水溶性藥物，能使藥物具有靶向性，提高和延長療效，緩和毒性，避免耐藥性產生和改變給藥途徑等[6]。脂質體作為一種新型藥物載體，在皮膚病治療方面，具有增加難溶性藥物溶出度[7]、對皮膚組織具有靶向性、長效緩釋性并可降低藥物毒副作用等優點[8]；目前已有柚皮苷脂質體制備工藝的報道[9]，也有將柚皮苷制成外用乳膏的報道[10]。凝膠劑作為新型藥物制劑，具有良好的生物相容性，對藥物釋放具有緩釋、控釋作用，制備工藝簡單且易于涂布使用，局部給藥后易吸收、不污染衣物，穩定性較好[11]。為此，本課題組利用柚皮苷的抗炎、抗過敏活性，擬以柚皮苷脂質體為模型藥物，將其開發成外用制劑柚皮苷脂質體凝膠，對其劑型進行改革，填補國內柚皮苷凝膠劑型的空白，為擴大柚皮苷臨床應用提供試驗依據。本試驗先以包封率為指標，采用正交試驗對柚皮苷脂質體的制備方法進行研究，再對柚皮苷脂質體凝膠處方進行優化，報道如下。

1 材料

1.1 儀器

1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；S21-1型磁力攪拌器（上海予騰生物科技有限公司）；RE-3000A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-3 型循環水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；ZSBB-712 型恒溫水浴（上海智城分析儀器制造有限公司）；PB602-S 型電子天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SCQ-8201E 型超聲清洗儀（上海聲彥超聲波儀器設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

柚皮苷原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號：76674-20-1，純度：＞99.0%）；柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110722-200309，純度：＞99.0%）；卡波姆（型號：940，廊坊聚通化工有限公司，批號：20120116）；甲醇為色譜純，膽固醇、卵磷脂、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、冰醋酸、三乙醇胺、羥苯乙酯、甘油、月桂氮酮、三氯化鋁等均為分析純，純化水系自制。

2 方法與結果

2.1 柚皮苷脂質體的制備

基本處方組成：柚皮苷40 mg，磷脂400 mg，膽固醇100 mg。分別采用以下方法制備脂質體。

2.1.1 薄膜分散法 將藥物、磷脂、膽固醇等類脂質溶于二氯甲烷中，室溫減壓蒸干溶劑，使在燒瓶內壁上形成均勻薄膜，加入磷酸鹽緩沖液，不斷旋轉燒瓶，至形成均勻分散的淡黃色半透明膠體溶液，即得淡黃色脂質體。

2.1.2 逆相蒸發法 將藥物、磷脂等膜材溶于二氯甲烷中，加入磷酸鹽緩沖液（水溶液-有機溶劑之比為1 ∶3）進行短時超聲，直至形成穩定的W/O 型乳劑。然后減壓蒸發除去有機溶劑，達到膠態后，滴加磷酸鹽緩沖液，旋轉助瓶壁上的凝膠脫落，減壓后繼續蒸發，即得脂質體溶液。

2.1.3 乙醇注入法 將藥物、磷脂、膽固醇等充分溶解于乙醇中，快速注入恒溫攪拌中的磷酸鹽緩沖液，繼續攪拌揮去有機溶劑，再通過孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，即得脂質體溶液。

2.1.4 包封率測定 取上述3 種方法制得的脂質體，按文獻[12]方法，采用葡聚糖凝膠柱層析法測定其包封率，包封率＝經柱分離的脂質體中含藥量/總藥量×100%。結果薄膜分散法包封率為23.08%，逆相蒸發法為20.05%，乙醇注入法為40.21%。即相同條件下，乙醇注入法法優于其他兩種方法。以下以乙醇注入法制備脂質體。

2.1.5 正交試驗優化脂質體處方 選用乙醇注入法制備柚皮苷脂質體，參考文獻[13]及在單因素考察的基礎上選擇磷脂質量濃度（A）、磷脂-膽固醇質量比（B）和脂藥比（C）為考察因素，按L9（34）正交表進行試驗。因素與水平見表1，正交試驗設計安排及結果見表2，方差分析見表3。

表1 脂質體處方優化正交試驗因素與水平Tab 1 Factor and level of orthogonal experiment of the liposomes formulation optimization

表2 脂質體處方優化正交試驗設計及結果Tab 2 Design and results of orthogonal experiment of the liposomes formulation optimization

表3 脂質體處方優化正交試驗方差分析結果Tab 3 Analysis results of variance of the liposomes formulation optimization

由表2、表3結果分析可知，各因素對柚皮苷脂質體包封率影響的主次順序為A＞B＞C，即磷脂質量濃度為主要影響因素且具顯著性，其次為磷脂-膽固醇質量比，脂藥比影響最小。確定的最優工藝條件為A2B1C3，即磷脂質量濃度為30 mg/ml、磷脂-膽固醇質量比為3∶1、脂藥比為10∶1。

制備方法為：取柚皮苷30 mg、磷脂溶液10 ml（30 mg/ml，相當于磷脂300 mg）、膽固醇100 mg充分溶解于適量乙醇中，快速注入恒溫攪拌中的磷酸鹽緩沖液，繼續攪拌揮去有機溶劑，再通過孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，即得脂質體溶液。

2.1.6 驗證試驗 按上述制備方法平行制備3 份柚皮苷脂質體，測定包封率，結果分別為40.18%、40.23%、40.15%，平均包封率為40.19%（RSD＝0.10%，n＝3）。該值高于正交試驗表中任一條件下的包封率，表明該脂質體處方工藝可行且穩定。

2.2 柚皮苷脂質體凝膠的制備

2.2.1 柚皮苷脂質體凝膠防腐劑用量的選擇 固定載藥量為1.0 g/20 g（每20 g 凝膠中含柚皮苷脂質體1.0 g），以卡波姆0.30 g、三乙醇胺1.0 g、甘油0.4 g、10%月桂氮酮無水乙醇溶液2 g，制成凝膠20 g，同法制備5份，分別加入5%羥苯乙酯乙醇溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5 g，攪勻。

以細菌數、霉菌數和酵母菌作為考察指標，將所制凝膠置于無菌白色透明玻璃容器中并密封，于室溫下放置0、30 d后，按薄膜過濾法檢查，結果見表4。

表4 防腐劑用量考察結果Tab 4 The amount of preservatives

由表4可見，選擇5%羥苯乙酯乙醇溶液用量為0.3 g即可達到防腐要求。

2.2.2 正交試驗優化凝膠處方 在參考文獻[14-15]及前期單因素考察的基礎上，選取影響凝膠劑質量的卡波姆用量（A）、三乙醇胺用量（B）和載藥量（C）為考察因素（各水平取值均指制成20 g 凝膠時的用量；載藥量指制成20 g 凝膠時加入柚皮苷脂質體的量），按L9（34）正交表進行試驗，采用綜合評分法對正交試驗數據進行分析。綜合評分標準見表5，因素與水平見表6，正交試驗設計安排及結果見表7，方差分析見表8。

表5 綜合評分標準Tab 5 Comprehensive scoring criteria

由表7、表8可知，柚皮苷脂質體凝膠中各因素影響的主次順序為C＞A＞B，即載藥量為主要影響因素且具顯著性，三乙醇胺用量影響最小。確定的最優處方為A2B3C3，即卡波姆0.30 g、三乙醇胺1.0 g、載藥量1.0 g/20 g（即每20 g凝膠含柚皮苷脂質體1.0 g）。

表6 凝膠處方優化正交試驗因素與水平Tab 6 Factor and level of orthogonal experiment of the gels formulation optimization

表7 凝膠處方優化正交試驗設計及結果Tab 7 Design and results of orthogonal experiment of the gels formulation optimization

表8 凝膠處方優化正交試驗方差分析結果Tab 8 Analysis results of variance of the gels formulation optimization

2.2.3 驗證試驗 按優選的處方工藝，制備總量為20 g凝膠3批：稱取基質卡波姆0.3 g置于小燒杯中，加入甘油0.4 g，攪拌均勻使其全部潤濕，加入純化水適量使完全溶脹，得空白凝膠，備用。另稱取柚皮苷脂質體1.0 g，加入5%羥苯乙酯乙醇溶液0.4 g和10%月桂氮酮無水乙醇溶液2.0 g，混勻，加至空白凝膠中，攪拌使其分布均勻，加入1.0 g三乙醇胺，攪拌均勻，即得。制備3 批凝膠，放置30 d 后觀察。結果其外觀均勻、細膩，易涂展，成型性良好，綜合評分分別為9.8、9.9、9.8，平均值9.8，微生物限度檢測均符合規定。

2.3 柚皮苷脂質體凝膠的質量控制

2.3.1 性狀 本品為淡黃色半固體凝膠。

2.3.2 鑒別（1）吸取經處理后的供試品溶液和對照品溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸-水（8∶4∶0.2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱1 min，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。（2）在“2.3.4”項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間與對照品峰的保留時間一致。

2.3.3 檢查 應符合凝膠劑項下的有關規定[16]。

2.3.4 含量測定（1）色譜條件。參考2010 年版《中國藥典》（一部）“骨碎補”含量測定項下色譜條件[16]。（2）供試品溶液制備。取本品0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加甲醇30 ml，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置于50 ml量瓶中，用少量甲醇分數次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。（3）方法學考察。按相關方法進行。結果柚皮苷的線性回歸方程為y＝13 482x－6.548（y為峰面積，x為質量濃度，r＝0.999 3），檢測線性范圍為5.8～58 μg/ml，定量限為5.8 μg/ml；精密度試驗中柚皮苷峰面積的RSD 為1.53%（n＝6）；穩定性試驗中柚皮苷峰面積的RSD為1.93%（n＝6），供試品溶液在24 h內穩定性良好；回收率試驗中低、中、高質量濃度的平均回收率為100.83%（RSD＝1.98%，n＝3）；專屬性試驗中各成分不干擾主成分的測定。

測定3 批凝膠中柚皮苷含量，結果分別為0.54%、0.61%、0.59%，平均值為0.58%，占標示量的96.67%，符合質量要求。

3 討論

近幾年來，對中藥有效成分的研究與開發成了一個熱點，本文即對中藥有效成分柚皮苷進行相關制劑研究，為其開發成外用制劑提供基礎。

中藥水性凝膠劑具有美觀、易涂布、不油膩、易洗除等優點。影響凝膠劑成型的因素有載藥量、基質、pH調整劑（如三乙醇胺）以及保濕劑等的用量等。本試驗以凝膠的成型性、涂展性和穩定性3個指標的綜合作用進行評價，利用正交試驗設計系統地考察了影響凝膠質量的工藝條件，制備出柚皮苷脂質體凝膠。柚皮苷脂質體凝膠具有制備簡單，使用、攜帶方便等優點，且患者依從性高。

卡波姆具有易于涂展、黏附性好、易清洗、無油膩感、能吸收組織滲出液、對皮膚無刺激性等特點，常作為凝膠劑骨架材料被廣泛用于緩控釋經皮制劑的制備，其用量會直接影響凝膠黏度和藥物的釋放，一般選用質量分數為0.5%～2.0%[17]。

本研究在實驗室條件下制備了柚皮苷脂質體凝膠劑，按優選工藝條件制備的凝膠外觀、涂展性、穩定性等均符合規定，但作為新劑型，還有待進一步對其刺激性、藥物的透皮吸收、藥物的體外抗菌作用進行相關考察。

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