復方葛根片對糖尿病腎病模型大鼠腎組織的保護作用

楊文超，顧正位，路其康，王飛飛，畢云生，張淑瑜，于燕莉#（.山東中醫藥大學藥學院，濟南 50355；.濟南軍區總醫院藥劑科，濟南 5003）

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病導致的嚴重慢性并發癥之一，是造成糖尿病患者死亡的主要原因，目前在我國發病率逐年攀升[1]。復方葛根片系濟南軍區總醫院醫院制劑，處方由葛根、丹參、茵陳和延胡索組成，具有活血化瘀、生津養心之功效，臨床主要用于冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾病的治療。但通過近幾年院內臨床觀察，發現復方葛根片還可糾正糖尿病腎病患者的脂質代謝紊亂、降低尿蛋白水平，對腎功能具有明顯的改善作用。為深入探討其在此方面的作用，筆者在本研究中采用高糖高脂飼料聯合鏈脲佐菌素建立DN大鼠模型[2-4]，觀察復方葛根片對DN模型大鼠腎組織的影響。

1 材料

1.1 儀器

B600A 型醫用低速離心機（河北省安新縣白洋離心機廠）；穩豪型血糖儀[強生（中國）有限公司]；DXC800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）；精密電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（STZ，上海源葉生物科技有限公司，批號：GN0517BA14，純度：≥98.5%，臨用前用檸檬酸緩沖液配制成pH為4.4的1%STZ溶液）；復方葛根片（濟南軍區總醫院藥劑科制劑室，批號：20141013，規格：每片0.4 g，其中含生藥量0.3 g）；厄貝沙坦片（陽性藥物，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批號：4A241，規格：每片150 mg）。

1.3 動物

2 方法

2.1 分組及造模方法

72 只大鼠自購入后適應性喂養7 d。大鼠隨機分為正常組10 只，給予普通飼料喂養；造模組62 只，給予高脂飼料（脂類12.5%、糖20%、膽固醇2.5%、蛋黃粉5%，其余為礦物質和維生素）喂養42 d。禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg，正常組給予等體積0.1 mol/L 枸櫞酸緩沖液。造模組72 h后尾部取血測空腹血糖（FBG），以FBG≥16.7 mmol/L、伴有尿量增加者確定造模成功，不達標者予以剔除，并繼續給予高脂飼料。隨后將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組與復方葛根片高、中、低劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法

自DN造模成功1周后開始給藥，給藥量按大鼠與人體型系數計算[5]，以臨床給藥劑量作中劑量組，2 倍量作高劑量組，0.5倍作低劑量組；陽性對照組給予厄貝沙坦片0.013 g/（kg·d）。復方葛根片高、中、低劑量組分別給予復方葛根片0.406、0.203、0.102 g/（kg·d），臨用前加蒸餾水溶解，使給藥量為10 ml/kg；正常組與模型對照組給予等體積蒸餾水。每天灌胃給藥1次，共56 d。其中，部分大鼠在給藥中死亡。給藥56 d末，腹主動脈取血，取腎臟，用于檢測各項指標。

2.3 觀察指標

（1）一般情況：尿量、飲水量、進食量、體質量、體毛、精神狀態等。（2）生化指標：在給藥后第1、14、28、42、56 d分別檢測FBG和24 h尿蛋白；末次給藥后，禁食不禁水24 h，腹主動脈取血，取腎臟，檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及腎臟系數（KI）。（3）腎臟組織病理學觀察：腎臟用10%中性甲醛固定液固定，常規脫水、浸蠟、包埋，制備組織切片，脫蠟，蘇木精-伊紅（HE）染色，蓋片后光鏡下觀察[6]。

2.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理。計量資料用均數±標準差（）表示，對FBG、24 h 尿蛋白采用重復測量設計資料的方差分析進行比較[7]，多組間單因素比較先進行正態分析，再采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況變化

造模組大鼠造模6～7 d 后逐漸出現多飲、多食、多尿、體質量逐漸下降、弓背蜷縮等現象，隨著時間延長，精神萎靡、少動抱團的表現越突出。與模型對照組比較，陽性對照組及復方葛根片高、中、低劑量組大鼠體質量、皮毛潤澤度及柔順度、精神和活動量方面均有所改善；正常組大鼠體質量逐漸增加，皮毛潤澤、光潔，動作靈敏，精神飽滿。

3.2 復方葛根片對DN大鼠FBG的影響

與正常組比較，造模后大鼠FBG明顯升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和復方葛根片低劑量組大鼠FBG未見明顯變化（P＞0.05），高劑量組大鼠FBG從第42天開始明顯降低（P＜0.05），中劑量組大鼠在第56 天降低明顯（P＜0.05），其中以高劑量組差異最為顯著。各組大鼠FBG測定結果見表1。

表1 各組大鼠FBG測定結果（）Tab 1 FBG of rats in each group（）

表1 各組大鼠FBG測定結果（）Tab 1 FBG of rats in each group（）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 復方葛根片對DN大鼠24 h 尿蛋白的影響

與正常組比較，造模后各組大鼠24 h 尿蛋白從第28 天開始顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組與復方葛根片高、中、低劑量組在給藥28 d 后24 h 尿蛋白水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。各組大鼠24 h尿蛋白測定結果見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白測定結果（）Tab 2 24 h Upro of rats in each group（）

表2 各組大鼠24 h尿蛋白測定結果（）Tab 2 24 h Upro of rats in each group（）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.4 復方葛根片對DN大鼠SCr、BUN、KI、TC和TG的影響

與正常組比較，模型對照組大鼠BUN、TC、TG、KI水平升高（P＜0.01），同時SCr水平降低（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組及復方葛根片高、中劑量組大鼠BUN、TC、TG、KI 水平降低，SCr 水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01 或P＜0.05）；復方葛根片低劑量組SCr 水平升高（P＜0.01），BUN、KI、TC、TG 水平降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；復方葛根片各劑量組間比較，SCr、BUN、KI、TC、TG水平差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠SCr、BUN、KI、TC、TG 檢測結果詳見表3。

表3 各組大鼠SCr、BUN、KI、TC和TG檢測結果（）Tab 3 SCr，BUN，KI，TC and TG of rats in each group（）

表3 各組大鼠SCr、BUN、KI、TC和TG檢測結果（）Tab 3 SCr，BUN，KI，TC and TG of rats in each group（）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.5 腎臟組織病理檢查

3.5.1 腎臟的一般形態 肉眼可見正常組大鼠腎臟色澤紅潤、大小適中，且腎臟表面潤滑有彈性；模型對照組大鼠腎臟呈偏暗黃色，腫脹、增大明顯，有可見斑點；陽性對照組和復方葛根片各劑量組大鼠腎臟略有腫脹，顏色輕度偏黃。

3.5.2 腎臟的光鏡檢查結果 正常組大鼠腎臟組織結構清晰、完整，腎小球系膜細胞未見增多，系膜區未見增寬，系膜基質未見增加；腎間質內未見炎細胞浸潤、充血及水腫；腎間質血管壁未見增厚，腎小管結構無異常。模型組大鼠可見腎小球明顯肥大，基底膜增厚，系膜基質增生積聚，出現腎間質炎細胞浸潤、部分纖維化及腎小球硬化的病理現象。與模型對照組比較，陽性對照組大鼠腎小球基本正常，腎小管無明顯改變，腎間質無纖維化及炎細胞浸潤；復方葛根片高、中劑量組大鼠腎臟病變均有所改善，腎間質無明顯炎細胞浸潤，腎間質血管壁無明顯增厚，腎小管結構無明顯異常，3 個劑量組間未見明顯差異；低劑量組大鼠腎小球基底膜輕度增厚，系膜基質輕度增生，腎間質內可見部分炎細胞浸潤，但優于模型對照組。各組大鼠腎臟病理組織切片詳見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理組織切片（HE，×100）A.正常組；B.模型對照組；C.陽性對照組；D.復方葛根片高劑量組；E.復方葛根片中劑量組；F.復方葛根片低劑量組Fig 1 Renal pathological tissue section of rats in each group（HE，×100）A.normal group；B.model control group；C.positive control group；D.Compound pueraria tablets high-dose group；E.Compound pueraria tablets medium-dose group；F.Compound pueraria tablets low-dose group

4 討論

DN是在糖尿病基礎上對腎臟造成的慢性進行性損傷，在臨床上主要表現為持續性的蛋白尿。DN 主要的病理特征是腎小球體積肥大、基底膜增厚、系膜基質增加，進而造成腎小球硬化。從本實驗模型對照組大鼠病理形態學分析的結果可見腎小球明顯肥大、系膜增厚、細胞外基質增生；腎間質內可見炎細胞浸潤，出現部分水腫及腎小球硬化。本實驗在第28天時造模各組大鼠蛋白尿量與正常組比較明顯增加（P＜0.01），表明造模組大鼠出現腎功能損害，繼而導致了DN的發生，可見本次實驗DN模型復制成功。

本實驗結果表明，與模型對照組比較，復方葛根片高、中劑量組FBG、24 h 尿蛋白、BUN、KI、TC、TG 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），SCr 含量明顯升高（P＜0.01），脂質代謝紊亂得以糾正，尿蛋白減少，腎組織病理形態改善。這表明復方葛根片各劑量對血脂和腎功能有不同程度的改善。實驗中正常組大鼠血清SCr含量高于造模組大鼠，分析原因是造模組大鼠體質量減輕，內生SCr量隨之減少所致；實驗后期，由于腎小球基底膜通透性增大，濾過增加，導致血清中SCr含量減少。

中醫學認為DN 是因糖尿病患病日久，引起瘀血阻滯、深入腎絡所致，在中醫學上屬于“絡病”的范疇。因此，治療DN應以活血化瘀通絡為主[8-10]。本研究所用復方葛根片，方中主藥葛根升陽生津、充養血脈，同時兼具活血化瘀之功，藥理研究表明葛根的有效成分葛根素具有清除氧自由基、保護血管內皮、改善胰島素抵抗、降低血糖血脂的作用[11-12]。丹參性微寒，善能通行血脈、祛瘀通痹，同時又能祛瘀而不傷正、止血而不留瘀；藥理研究表明丹參中丹參酮ⅡA能修復腎組織、改善微循環、增加腎組織血流量、改善腎間質纖維化并延緩其進程[13-14]；丹酚酸B 可以抑制腎小球系膜細胞的過度增殖，改善基質蛋白生成和沉積的狀態[15]。延胡索辛散溫通，為活血行氣止痛之良藥，與丹參相須配伍，以增強活血祛痹之功。茵陳則可清肝利膽、調暢氣機。方中諸藥合用，各秉所長，故能發揮活血化瘀、生津祛痹之效。

筆者采用生化指標聯合腎臟組織病理學觀察的方法，探討了復方葛根片對DN 模型大鼠腎組織的保護作用。結果證明，復方葛根片具有改善大鼠糖尿病腎損傷的作用。

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