解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7對采后蘋果輪紋病的生物防治作用

黃玲玲 ，裘紀瑩，唐 琳，陳相艷，劉孝永，周慶新，王永慧，陳蕾蕾

(1山東省農業科學院農產品研究所，濟南 250100;2山東師范大學生命科學學院，濟南 250014;3山東省臨沂市河東區農業局，山東臨沂 276034)

采后腐爛是水果采后需要預防的一個重要問題，發達國家10%—30%的水果是損失于采后腐爛，在發展中國家損失率更大［1］。果蔬采后腐爛主要是真菌病害［2］，而蘋果的采后損失主要由輪紋病和炭疽病引起。蘋果輪紋病菌通過危害蘋果樹的枝干和果實，引起采前和采后蘋果輪紋病的發生［3］。目前控制蘋果輪紋病的方法仍然以化學藥劑為主，尤其是果園蘋果輪紋病的防治中長期使用化學農藥，造成果園的污染［4］，同時病菌抗藥性的產生導致傳統化學藥劑的防效降低［5，6］，應該加以重視。采后蘋果輪紋病的防治也多采用化學藥劑浸泡的方法，如采用500 倍復方多菌靈預先浸泡1min，再自然晾干貯藏［7］。由于使用化學農藥的種種危害，目前科學界在不斷地尋找一些新型低毒可替代化學殺菌劑。鄒宗峰等［8］開展了新型農藥60.00%唑醚·代森聯(百泰)WG 和25.00%吡唑醚菌酯(凱潤)EC 防治蘋果輪紋病的試驗，結果顯示這兩種新型農藥的防治效果比較理想。王芳芳［9］研究了水楊酸對采后蘋果果實輪紋病的抑制效果，還有一些研究者利用生物防治的方法抑制采后蘋果輪紋病，比如某些地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、木霉、熒光假單胞菌等菌體及其代謝產物的單種或復合生物防治都有一定的效果［10-12］。

解淀粉芽孢桿菌屬于芽胞桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌具有很高親緣性并且具有廣泛抑菌譜的細菌，其菌體及一系列代謝產物可以抑制細菌以及真菌的生長［13-15］，并且毒性較低［16］，是一類很有前途的生防制劑來源。目前已經開發出以解淀粉芽孢桿菌為活性成分的微生物殺菌劑，并獲得了生產許可［17］。同時，目前文獻報道的解淀粉芽孢桿菌抗菌代謝產物有伊枯草菌素、桿菌霉素D、表面活性素等脂肽類抗生素［18-21］以及抗菌蛋白等［22，23］。本研究通過探討解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 菌體及其抗菌蛋白對蘋果輪紋病菌LW182 的抑制作用以及對采后蘋果輪紋病的生物防治作用，以期更深入地了解解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 的產業化應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果:市售紅富士;解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 由本實驗室分離、鑒定、保存;輪紋病菌LW182 由山東省農業科學院植物保護研究所惠贈。牛肉膏蛋白胨培養基［24］用于拮抗菌的培養和保存;PDA 培養基［24］用于病原菌的培養、保存和牛津杯法測定抑菌效果;發酵培養基［25］用于拮抗菌胞外抗菌蛋白的發酵，具體配方為:葡萄糖5g，酵母浸膏7.5g，蛋白胨7.5g，(NH4)2SO45g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0;納他霉素購自上海耐今實業有限公司。

1.2 儀器與設備

CR22GⅢ高速冷凍離心機，日本日立公司;Stirred Cell Model 8400 超濾裝置(配有3000u 超濾膜和氮氣罐)，美國Millipore;霉菌培養箱，韶關市泰宏醫療器械有限公司;PQX-430D 智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.3 牛津杯法測定抑菌效果

1.3.1 病原菌孢子菌懸液的制備

將蘋果輪紋病菌LW182 接種于PDA 平板，28℃培養7d，即為病原菌平板。無菌條件下用直徑7mm 打孔器打孔取一環放入滅菌的1.5mL EP 管中，用無菌刀片切碎并添加1mL 無菌水混勻，制備病原菌孢子菌懸液，4℃保存，備用。

1.3.2 處理液的制備

將拮抗菌NCPSJ7 接種于牛肉膏蛋白胨平板，37℃培養24h。挑取單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37℃，180r/min 搖床培養24h，按3%接種量將已活化好的拮抗菌接入發酵培養基中，37℃，180r/min 搖床培養6d，既得供試發酵液。發酵液于4℃，10 000r/min 離心20min，取出上清液，菌體沉淀加無菌水清洗再離心，最后調節菌濃度約為105個/mL，既得供試菌懸液。發酵上清液經超濾杯用截留分子量為5KDa 的膜超濾，濃縮5 倍，并用0.22μm 濾膜過濾除菌，即為供試胞外抗菌蛋白粗提液。

1.3.3 抑菌圈試驗

取100μL 病原菌孢子菌懸液于空白平皿中，倒入PDA 培養基混勻，待凝固后，每個平板放入1 個牛津杯，分別添加菌懸液、發酵液及不同濃度的胞外抗菌蛋白粗提液100μL，于28℃培養7d 后觀察牛津杯周圍的抑菌圈直徑，并以無菌水作為空白對照。

1.4 果實打孔接種法試驗抑菌效果

1.4.1 果實預處理

分別選擇無病害、無傷口、成熟度和大小一致的市售紅富士蘋果，用2%NaClO 浸泡2min，再用自來水沖洗干凈，自然晾干。

1.4.2 果實打孔接種法試驗

在果實表面用7mm 打孔器打直徑7mm，深5mm 的孔，在傷口處接種20μL 病原菌孢子菌懸液以檢測病原菌果實致病性，將果實放入保鮮盒，置于相對濕度95%左右，28℃的恒溫培養箱，定期觀察梨果實腐爛情況。在每個傷口接種20μL 病原菌孢子菌懸液，并且分別接種40μL NCPSJ7 發酵液、菌懸液和抗菌蛋白粗提液來檢驗NCPSJ7 對接種蘋果的輪紋病菌的抑制效果。以單獨接種病原菌孢子菌懸液和無菌水的果實為陽性和陰性對照。每次處理3 個果實，重復3 次。

1.5 果實防腐試驗

分別將NCPSJ7 發酵液、抗菌蛋白粗提液和那他霉素(3mg/mL)與病原菌孢子菌懸液以2∶1 的比例混勻，均勻噴灑在處理好的蘋果表面，待蘋果自然晾干后用保鮮盒分裝，并置于相對濕度90%，28℃的人工氣候箱中，定期觀察記錄果實腐爛情況。分別以單獨噴灑病原菌和無菌水的果實為陽性和陰性對照。每組處理10 個蘋果。壞果率計算:壞果率/%=壞果數(個)/果實總數(個) ×100%。

2 結果與討論

2.1 牛津杯法測定抑菌效果

首先考察NCPSJ7 菌懸液、發酵液及胞外抗菌蛋白粗提液對蘋果輪紋病病原菌LW182 的平皿抑制效果(表1)。結果顯示，各處理液對蘋果輪紋病菌LW182 均有一定的抑制作用，其中菌懸液的抑制效果最好，其次是發酵液，但是兩者差異不是特別明顯。胞外抗菌蛋白粗提液和菌懸液、發酵液相比，效果略差，但是抑菌效果也比較明顯。

表1 不同處理液對病原菌蘋果輪紋病菌LW182 的抑制作用

2.2 果實打孔接種法試驗抑菌效果

首先驗證蘋果輪紋病病原菌LW182 對蘋果果實的致病性，從附圖可見，采用打孔法接種的LW182 具有很強的侵染蘋果果實的能力，主要表現為:整個蘋果腐爛，蘋果表面輪紋狀斑紋、變色和出水比較嚴重，接種區域有明顯的病原菌菌絲生長。可見，LW182 可以作為蘋果輪紋病侵染蘋果的指示菌。

附圖 LW182 侵染蘋果試驗

進一步研究NCPSJ7 對打孔法接種蘋果的輪紋病菌LW182 的抑制效果，結果如表2 所示。和陽性對照相比，供試的NCPSJ7 各處理液對接種果實的輪紋病菌LW182 均有很好的抑制作用，主要表現為:果實病斑直徑明顯變小，而且具有比較明顯的抑制病原菌菌絲生長和防止果實變色作用。同時抑制效果的差異較大，3 種處理液中以抗菌蛋白粗提液效果最好。用抗菌蛋白粗提液處理后的果實病斑直徑小，接種區域無菌絲生長，果實表面不變色。

表2 NCPSJ7 處理液對接種蘋果病原菌的抑制

2.3 果實防腐試驗

采用發酵液和抗菌蛋白粗提液進行蘋果防腐保藏試驗，結果如表3、表4 所示。從表3 來看，噴灑NCPSJ7發酵液及其稀釋液的3 個試驗組中，保藏前期的壞果率隨發酵液濃度的降低而降低，保藏后期的壞果率隨發酵液濃度降低而增加。和陽性對照相比，發酵液原液組前期壞果率比陽性對照高，后期比陽性對照略低。分析可能的原因是輪紋病菌LW182 侵染蘋果有一定的潛伏期，前期侵染能力不強，但潛伏期后的侵染迅猛。而果實保藏前期濃度較高的拮抗菌會侵染損傷果加速其腐爛，導致保藏前期的壞果率高。發酵液的10 倍和100 倍稀釋液組可以延緩果實腐爛，但保藏后期作用不明顯，可能是濃度較低的拮抗菌不足以發揮其防腐作用。

表3 發酵液的蘋果防腐保藏試驗結果(壞果率，%)

從表4 來看，采用胞外抗菌蛋白處理蘋果，陽性對照組于7d 后開始腐爛，而胞外抗菌蛋白處理組12d 才開始腐爛。尤其是20d 以后，陽性對照組腐爛迅速，而胞外抗菌蛋白處理組的壞果率明顯低于陽性對照組，并且效果與那他霉素相當。可見，NCPSJ7 胞外抗菌蛋白處理能有效降低LW182 對蘋果的侵染，從而降低壞果率，延長保藏期。

表4 胞外抗菌蛋白的蘋果保藏試驗結果(壞果率，%)

3 結論

本文采用平板牛津杯法、果實打孔接種法研究解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 菌懸液、發酵液和抗菌蛋白粗提液對蘋果輪紋病菌LW182 的抑制作用，采用果實防腐試驗研究發酵液和抗菌蛋白粗提液在采后蘋果輪紋病生物防治中的應用價值。牛津杯法的結果顯示菌懸液對LW182 的抑制效果最好，其次是發酵液，抗菌蛋白粗提液的效果略差，但是抑菌效果也比較明顯。果實打孔接種法顯示抗菌蛋白粗提液的抑制效果非常好，可明顯減小果實病斑直徑，抑制接種區域病原菌菌絲生長及果實變色，發酵液和菌懸液的效果略差，但和陽性對照相比，抑制作用也比較明顯。可見，供試的3 種處理液對蘋果輪紋病菌LW182 都有很好的抑制作用，但是采用上述兩種方法得到的結果也有不一致之處，供試處理液對病原菌的抑制效果受載體的影響很大。采用發酵液和抗菌蛋白粗提液噴灑蘋果表面進行防腐保藏效果的研究，結果抗菌蛋白粗提液對同時噴灑蘋果輪紋病菌的果實具有非常明顯的防治作用，效果和納他霉素相當，但發酵液的效果不明顯。這和我們前期進行的梨青霉病生物防治的結果類似。可見，解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 主要是通過分泌抗菌蛋白來抑制蘋果輪紋病菌，而且NCPSJ7 菌體可能對蘋果果實產生一些危害。所以，NCPSJ7 抗菌蛋白適合用于防治蘋果輪紋病，但直接利用該菌株的菌體進行生物防治的構想是不現實的。下一步我們將對解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 胞外抗菌蛋白的噴霧干燥工藝及與其它防腐劑、保鮮劑的復配等開展進一步的研究。

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