膠原多肽對亞急性酒精中毒大鼠的保護作用研究

林 兵，于永超，陳 禹，石 勱，楊勤兵

(1中日友好醫院營養科，北京 100029;2北京清華長庚醫院臨床營養科/清華大學醫學中心，北京 102218)

亞急性酒精中毒的病程介于急慢性酒精中毒之間，是慢性酒精中毒的早期損傷，主要表現為肝功能損傷、營養素代謝紊亂和神經系統損傷等方面。生物活性肽對于酒精中毒的保護作用已有報道，如玉米寡肽［1］、谷胱甘肽［2］等。本研究采用的膠原多肽(Collagen Peptides，CPs)是一種來源于深海魚皮的寡肽混合物，易吸收、水溶性好、腸胃刺激小、價格便宜。已有研究顯示，CPs 具有多種生物活性，包括延緩細胞老化、降血壓、抑制學習記憶功能下降、抗衰老等［3］，而對于酒精中毒領域沒有相關的報道。本研究以膠原多肽作為干預物，觀察其對連續4w 攝入酒精大鼠的一般狀況、肝功能、脂質代謝、蛋白質代謝、氧化應激水平、乙醇代謝酶等的影響，首次評價其對亞急性酒精中毒大鼠的作用，為膠原多肽的應用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 膠原多肽

膠原多肽為淡黃色粉末狀，相對分子質量在100—860Da，以深海魚的魚皮為主要原料，采用復合偶聯酶解技術生產的小分子多肽混合物，由北京中食海氏生物技術有限公司提供。

1.2 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，雌性，8—10w 齡，體重220—250g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供，許可證號:SYXK (京)2011—0039，飼養環境溫度21—23℃，濕度50%—60%RH。

1.3 主要試劑和儀器

HITACHI 7180 全自動生化分析儀 (日本);肝ADH、組織蛋白(pro)、血清SOD、MDA 檢測試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供;UV7512GD 型紫外可見分光光度計，上海欣益儀器儀表有限公司;乙醇和叔丁醇為分析純。

1.4 實驗方法

大鼠按體重隨機分為正常對照組、模型對照組和CPs 高中低干預組，模型對照組12 只，其余每組10 只。乙醇稀釋為50%體積分數的酒精，灌胃劑量為15mL/kg，對照組蒸餾水灌胃15mL/kg。高中低干預組在酒精灌胃1h 后分別給予CPs 0.225、0.45 以及0.9g/kg·BW，對照組給予等劑量蒸餾水，每周稱重調整灌胃量。

記錄大鼠一般生活狀況和進食量，第29d 處死大鼠，股動脈取血，分離血清，檢測ALT、AST、ALB、TB、TC、TG、SOD 和MDA 水平，取部分肝組織檢查ADH 和組織pro 水平。

1.5 統計學處理

所有結果以均數± 標準差表示，數據分析采用SPSS15.0 統計軟件進行單因素方差分析，以LSD 法行兩兩比較，確定P＜0.05 時差異有統計學意義。

2 結果與分析

實驗結束時共48 只大鼠完成實驗，期間模型對照組和低劑量組各1 只大鼠因灌胃誤嗆入肺而導致死亡，低劑量組和高劑量組各有1 只因不能長期耐受酒精而死亡(長期精神萎靡，解剖肺部無明顯滲出)，其余48 只大鼠均存活。

2.1 大鼠體重變化

攝入酒精后模型對照組大鼠較正常對照組大鼠精神狀態差、食欲差、大便多溏瀉、反應遲鈍、而且活動減少，體重增長緩慢(P＜0.05)，干預組大鼠的癥狀比模型對照組輕，體重較模型對照組有升高的趨勢，但是不能逆轉體重的減輕，差異無統計學意義(表1)。

表1 大鼠體重變化(±s，g)

表1 大鼠體重變化(±s，g)

注:與正常對照組相比，△P＜0.05

2.2 血清肝功能指標

與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清中ALT、AST 顯著升高(P＜0.05)。與模型對照組相比，高劑量組大鼠的ALT 水平明顯下降(P＜0.05)，并且各劑量組大鼠血清的AST 水平明顯下降(P＜0.05)(表2)。

表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)

表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)

注:與正常對照組相比，△P＜0.05;與模型對照組相比，* P＜0.05

2.3 血清抗氧化指標

模型對照組大鼠的SOD 水平明顯降低，而血清MDA水平明顯升高(P＜0.05)。與模型對照組相比，各劑量組大鼠SOD 活性有升高的趨勢，低劑量組SOD 水平明顯升高(P＜0.05)，其余各組差異無顯著性;低劑量組和中劑量組的MDA 水平比模型對照組低，差異有統計學意義(表3)。

表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)

表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)

注:與正常對照組相比，△P＜0.05;與模型對照組相比，* P＜0.05

2.4 脂類與蛋白代謝變化

模型對照組的TG 和TC 含量較正常對照組明顯升高，而低劑量組和高劑量組大鼠血清TG 含量比模型對照低，差異有顯著性;高劑量組TC 含量比模型對照組低，差異有顯著性。模型對照組的TP 和ALB 與正常對照組相比無明顯差異，但是A/G 比的差異有顯著性，各劑量干預組并不能減小這種差異，反而有擴大的趨勢(表4)。

2.5 大鼠肝臟ADH 水平

模型對照和干預組組的ADH 活性比正常對照組高，但各組間差異無顯著性(正常對照組與模型對照組間P=0.087)(表5)。

表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)

表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)

注:與正常對照組相比，△P＜0.05;與模型對照組相比，* P＜0.05

表5 大鼠肝臟ADH 水平(±s)

表5 大鼠肝臟ADH 水平(±s)

3 討論

本研究采用酒精灌胃造成大鼠亞急性酒精中毒模型，研究CPs 對于酒精誘導大鼠早期損傷的保護作用。肝臟為酒精代謝的主要器官，肝損傷是酒精中毒最常見的靶器官，結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠一般狀況較差，體重增長緩慢，血清ALT、AST 比空白對照高，差異均有統計學意義。ALT 和AST 是肝細胞中的正常代謝酶，當肝細胞出現損傷時，這兩種轉氨酶進入血清便增多。通過測定血清轉氨酶的活性，即可作為肝細胞損傷的評價指標，大鼠轉氨酶的升高表明連續4w 飲酒造成了大鼠肝損傷，CPs 干預可以逆轉其中的某些變化，干預組大鼠血清ALT 和AST 水平較模型組降低，提示CPs 具有減輕酒精誘導的肝損傷的作用。進一步分析結果發現，血清ALT 的顯著變化常見于各種急性病毒性肝炎、藥物引起急性肝細胞損傷。相反，在酒精性肝炎中，AST 一般增高至正常值的2—10 倍，而ALT變化幅度較小［4］。結果顯示，模型組AST 升高的幅度(約2 倍)明顯高于ALT (約1/4)，這可能與酒精性肝炎的發生有關，肝臟炎癥反應是酒精性肝病的重要病理學改變［5］，提示CPs 可能具有減輕炎癥反應的作用。

目前，關于酒精中毒的致病機制仍有待確定，而氧化應激和脂質過氧化是普遍認可的病因之一［6］。機體大量攝入乙醇后，抗氧化物質消耗增加，而且酒精中毒使得抗氧化酶活性受到抑制，機體處于氧化應激狀態，早期的主要變化是其主要代謝場所——肝細胞發生膜脂質過氧化反應。其中，血清MDA 含量反應了機體脂質過氧化的程度。本實驗結果顯示，連續4w 攝入酒精后大鼠的SOD 活性下降，血清中MDA 水平升高。某些劑量CPs 干預使得大鼠SOD 活性升高，MDA 水平下降，表明CPs 可以在一定程度上矯正機體的氧化應激狀態，減輕脂質過氧化損害，這也與CPs 之前的研究結果相符［7］。

長期飲酒會造成機體營養素代謝紊亂，脂類代謝異常尤其常見。攝入酒精后大鼠血清TG 和TC 含量明顯升高(P＜0.05)，酒精引起機體脂類代謝紊亂在以往的研究中已有報道［4］，而以往研究也發現，膠原多肽具有改善脂類代謝的作用［8，9］。結果表明，低劑量和高劑量CPs 干預后大鼠血清TG 含量明顯降低，高劑量組大鼠TC 含量明顯下降，這表明CPs 具有一定的降血脂作用，這可能是減輕酒精中毒損害的重要機制。

酒精對于機體各組織器官的損傷與時間、劑量相關，呈現出蓄積作用，本實驗設計為誘導酒精中毒早期損傷，以肝損傷、脂代謝異常、氧化應激失衡等為主要表現，時間為4w，沒有觀察到中晚期酒精中毒如嚴重的代謝紊亂、肝硬化、乙醇代謝酶活性改變等表現。白蛋白由肝細胞合成，血清白蛋白濃度是肝臟的合成功能的評價指標，各種慢性肝病?？梢姷桶椎鞍籽Y［4］。4w酒精灌胃沒有造成大鼠血清白蛋白水平的變化，這表明肝合成功能并沒有受到影響。模型組A/G 比高于正常對照組(P＜0.05)，各劑量干預組并不能減小這種差異，具體的原因尚不清楚，可能與酒精致免疫系統的異常有關。ADH 是乙醇代謝的特異性酶，在慢性酒精中毒的過程中具有重要的作用，有研究者指出，隨著乙醇的持續攝入，ADH 的活性會隨之升高［10］，因此降低ADH的活性是減輕酒精中毒損害的重要機制，本研究模型對照組大鼠肝臟內的ADH 活性較正常對照組有一定的升高(t 檢驗P=0.087)，而CPs 干預后ADH 的活性有一定程度的下降，但是差異無顯著性。

綜上所述，CPs 對于酒精誘導的大鼠早期損傷具有保護作用，包括減輕肝臟損傷、提高機體抗氧化水平、改善脂類代謝等，其對于ADH、蛋白質代謝的影響仍需進一步的研究證實。

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