雙環醇治療大鼠慢性酒精性肝病的機制探討

董　力, 王　建, 賈晨虹, 郭琳娜

(1. 河北省廊坊市人民醫院 藥學部, 河北 廊坊, 065000;

2. 中國石油天然氣總公司中心醫院 藥劑科, 河北 廊坊, 065000;

3. 河北省廊坊市中醫醫院 藥房, 河北 廊坊, 065000;

4. 河北省廊坊市人民醫院 特需病房,河北 廊坊, 065000)

論著

雙環醇治療大鼠慢性酒精性肝病的機制探討

董力1, 王建2, 賈晨虹3, 郭琳娜4

(1. 河北省廊坊市人民醫院 藥學部, 河北 廊坊, 065000;

2. 中國石油天然氣總公司中心醫院 藥劑科, 河北 廊坊, 065000;

3. 河北省廊坊市中醫醫院 藥房, 河北 廊坊, 065000;

4. 河北省廊坊市人民醫院 特需病房,河北 廊坊, 065000)

摘要:目的探討雙環醇治療大鼠慢性酒精性肝病(ALD)的可能機制。方法72只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組，各24只。模型組和干預組分別給予白酒灌胃造模，干預組于第4周開始每日加用雙環醇灌胃，200 mg/(kg·d), 連續給藥4周；對照組給予等體積的生理鹽水。結果模型組肝臟呈進行性肝細胞損傷壞死及脂肪變性，干預組給藥后病變程度顯著輕于模型組大鼠。模型組第6、8周肝臟谷胱甘肽(GSH)含量及乙醛脫氫酶(ALDH)活性低于對照組(P<0.05或P<0.01)。干預組第6周GSH含量低于對照組，高于模型組(P<0.05), 第8周GSH含量及乙醇脫氫酶(ADH)、ALDH活性均高于模型組(P<0.05)。第6周，模型組大鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量高于對照組(P<0.05或P<0.01); 干預組大鼠TG低于模型組(P<0.01)。第8周，模型組大鼠血清各指標與對照組差異顯著(P<0.05); 干預組上述各指標與模型組差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結論雙環醇能有效抑制ALD導致的肝臟脂肪堆積，對酒精引起的肝組織、肝臟細胞結構損傷及肝功能損傷具有良好的保護作用。

關鍵詞:雙環醇; 慢性酒精性肝病; 肝細胞; 脂肪變性

慢性酒精性肝病(ALD)是由于長期過度飲酒引起的肝臟中毒性疾病，表現多樣，初期通常表現為脂肪肝，可進展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[1-3], 嚴重時可誘發廣泛肝細胞壞死甚或肝功能衰竭，目前中國ALD發病率有增多趨勢。雙環醇對多種實驗性肝損傷均有顯著保護作用，其作用機制可能為抑制化學毒物引起的肝細胞脂質過氧化，提高肝內谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽巰基轉移酶等自身抗氧化物含量，維持肝細胞線粒體膜流動性，加速毒性物質的代謝清除等[4]。本研究建立了大鼠慢性酒精性肝損傷模型，觀察雙環醇對ALD大鼠的保護作用，探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1　實驗動物

6周齡SPF級雄性SD大鼠72只，體質量180～200 g, 購自北京維通利華實驗動物技術公司，動物許可證編號NO.SCXK(京)2007-0001。標準飼料，自由飲水。

1.2　實驗材料

雙環醇(純度>99%，購自北京協和藥廠)，市售56°白酒，谷丙轉氨酶(ALT)、GSH、乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)測定試劑盒購于南京建成生物科技有限公司，膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒購自國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.3　造模及分組

SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組和干預組，各24只，每周測定各組大鼠體質量。模型組大鼠每日給予白酒灌胃，劑量為10 mL/kg, 2次/d, 間隔8 h, 持續8周；干預組大鼠每日以相同方式以白酒灌胃，并于第4周開始每日以雙環醇灌胃，劑量為200 mg/(kg·d), 連續給藥4周；對照組給予等體積的生理鹽水，持續8周。

1.4　肝臟組織形態學觀察

各組第6、8周最后一次給藥后取大鼠12只禁食12 h，取血并進行生化和酶活性檢測，斷頭處死，進行肝臟形態學觀察。處死大鼠后，迅速開胸取出完整肝臟，迅速切取適量肝臟組織，5%戊二醛固定，石蠟包埋，常規HE染色，鏡下觀察。余肝臟置于-4 ℃冰箱保存。

1.5　肝臟GSH含量、ADH、ALDH活性測定

取出肝臟，制備10%肝勻漿。嚴格按照GSH測定試劑盒操作，于412 nm波長測定吸光度值，按標準曲線計算GSH含量。取200 μL肝勻漿與等體積0.3%脫氧膽酸鈉溶液混勻冰浴20 min，4 000 g離心10 min，取上清液。嚴格按照ADH及ALDH測定試劑盒操作，于37 ℃下340 nm的波長連續測定單位時間內光密度變化值計算ADH活性，于25 ℃下340 nm的波長連續測定單位時間內光密度變化值計算ALDH活性。

1.6　血清相關生化指標檢測

嚴格按照試劑盒操作說明，于第6、8周采用分光光度法分別檢測血清ALT、TG、TC、HDL-C及LDL-C含量。

1.7　統計學方法

2結果

2.1　各組大鼠生理狀態比較

模型組大鼠均出現飲食減少，體質量增長減緩，毛發無光澤，部分脫落；白酒灌胃10 min后，出現步態不穩、眼球充血、嗜睡等癥狀，30 min～2 h后可恢復常態。干預組大鼠給藥前癥狀與模型組大鼠相似，給藥后體質量增長加快，行動較為敏捷靈活，毛發有光澤；對照組大鼠狀態良好，飲食正常，毛發有光澤，反應靈敏。

2.2　肝臟形態觀察

對照組大鼠肝竇結構清晰，肝小葉規則，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組大鼠酒精灌胃6周后，中央靜脈輕度擴張，中央靜脈周圍肝細胞水腫，不同程度空泡變性，可見小灶壞死和脂肪滴；8周后，中央靜脈壁增厚并出現血栓，肝組織膠原纖維增生，空泡變性加重，大量脂肪滴產生，肝小葉可見點狀壞死及炎癥細胞浸潤。干預組大鼠第6周肝細胞輕度水腫，少量空泡變性及脂肪滴；第8周肝組織空泡變性減少，脂肪滴較少，體積減小。

2.3　3組大鼠肝臟GSH、ADH、ALDH活性比較

3組第6、8周組內比較，各指標均無顯著變化(P>0.05)。模型組第6、8周GSH含量及ALDH活性低于對照組(P<0.05或P<0.01), ADH活性低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。干預組第6周GSH含量低于對照組，高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，第8周GSH含量及ADH、ALDH活性均高于模型組(P<0.05)，與對照組差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別時間/周GSH/(nmol/gprot)ADH/(U/mgprot)ALDH/(U/mgprot)對照組(n=12)66.33±0.527.29±1.268.67±1.0586.29±0.687.33±1.428.58±0.85模型組(n=12)64.51±1.42**6.32±1.267.68±1.21*84.15±2.05**6.01±1.757.21±2.01*干預組(n=12)65.64±1.01*#6.98±1.368.04±1.4185.88±1.30##7.92±1.37##8.85±1.73#

與同一時間對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與同一時間模型組比較，##P<0.01。

2.4　3組血清ALT、TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較

第6周，模型組大鼠血清ALT、TG、TC、LDL-C含量高于對照組(P<0.05或P<0.01)；干預組大鼠ALT高于對照組(P<0.05), TG低于模型組(P<0.01)。第8周，模型組大鼠血清ALT、TG、TC、LDL-C含量顯著高于對照組(P<0.01), HDL-C含量顯著低于對照組(P<0.05); 干預組大鼠TC含量低于對照組，HDL-C含量高于對照組，ALT、TG、LDL-C含量顯著低于模型組, HDL-C含量高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

組別時間/周ALT/(U/L)TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)對照組(n=12)634.67±6.422.64±0.152.71±0.345.52±0.950.92±0.15835.22±5.532.58±0.132.74±0.365.64±1.220.93±0.14模型組(n=12)646.36±10.52**3.27±0.18**3.12±0.57*5.02±1.111.17±0.25**867.82±13.64**3.64±0.22**3.55±0.62**4.35±1.20*1.35±0.34**干預組(n=12)642.76±10.22*2.73±0.21##3.02±0.665.22±0.861.02±0.33838.42±6.74##2.65±0.14##2.67±0.54*##7.34±2.42*##0.95±0.21##

與同一時間對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與同一時間模型組比較，#P<0.05, ##P<0.01。

3討論

雙環醇對化療藥物性肝損傷、酒精性肝損傷、脂肪肝、肝部分切除及缺血再灌注肝損傷，以及免疫性肝損傷具有保護作用，其機制可能與逆轉肝細胞內紊亂的氧化還原平衡體系，抑制炎癥物質生成及脂質過氧化、改善肝脂蛋白分泌及轉運等有關[5-6]。目前為止，慢性酒精性肝損傷的發生機制未完全闡明。大部分學者認為長期大量飲酒會造成微粒體乙醇氧化系統代謝產物增多，自由基大量生成，體內氧化還原平衡體系被打破，肝細胞氧化損傷[7]。同時體內細胞毒性物質乙醛生成量累積增加，加劇肝細胞膜以及微管損傷[8]。乙醇及乙醛的代謝可產生大量NADHM, 導致脂肪代謝紊亂，無法轉運出肝臟，導致脂肪滴在肝細胞積聚形成。

丁光偉等[9]的臨床研究顯示，雙環醇能夠顯著降低酒精性肝炎患者的ALT、AST、總膽紅素(TBIL)、r-谷氨酰轉肽酶，有效率達95.2%。雙環醇可通過保護肝細胞膜和線粒體、清除氧自由基、使肝細胞核DNA免受損傷及減少凋亡進而起到保肝作用。本研究使用56°白酒進行大鼠灌胃，成功建立了大鼠ALD模型[10]。結果可見，造模后肝細胞組織形態觀察見明顯腫脹和脂肪變性進行性加重，血清ALT持續升高，小葉中央靜脈肝擴張。雙環醇給藥明顯減輕酒精引起的肝細胞損及壞死，血清ALT呈下降趨勢，肝臟脂肪變和細胞腫脹等病理改變明顯改善[11-12]。

乙醇可動員外周脂肪分解，血液脂肪酸含量升高，使肝臟TG合成大量增加。此外，酒精可誘導對細胞色素P450表達，進而加重酒精代謝產物的肝毒性，導致肝細胞脂肪攝取增多，形成脂肪肝[13-14]。本研究結果顯示，模型組大鼠肝臟TG顯著升高，給予雙環醇后TG水平下降顯著。同時，雙環醇還可降低血清TC和LDL-C，升高HDL-C增加肝臟脂肪轉運，與蘇振和[12]的研究一致，表明雙環醇可有效抑制ALD導致的肝臟脂肪堆積，而其作用機制需進一步深入研究。

酒精主要經肝臟ADH/ALDH代謝，酒精使ALDH活性降低，乙醛代謝下降[15-16]。GSH是體內重要的抗氧化物，清除體內代謝產生的自由基。本研究中模型組大鼠給予酒精后，肝臟ADH以及ALDH活性進行性降低，GSH水平顯著下降。雙環醇口服給藥可通過誘導肝胞漿ADH及ALDH表達和激活，加速乙醛代謝清除，使GSH恢復至正常水平，與莫成林等[17]研究一致，表明雙環醇可促進GSH的再生，增強肝臟自由基的清除能力。

綜上所述，雙環醇不僅能有效抑制慢性酒精性肝損傷導致的肝臟脂肪堆積，保護肝竇組織、肝臟細胞、肝小葉中央靜脈結構等，對酒精引起的GSH含量下降、ALDH活性及ALT活性下降等也具有明顯改善作用，可抑制ALD引起的肝臟纖維化變性及壞死[18-19]。

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Exploration on mechanism of bicyclol in the

treatment of rats with chronic ALD

DONG Li1, WANG Jian2, JIA Chenhong3, GUO Linna4

(1.DepartmentofPharmacy,People′sHospitalofLangfangCity,Langfang,Hebei, 065000;

2.DepartmentofPharmacy,CNPCCentralHospital,Langfang,Hebei, 065000;

3.PharmacyRoom,LangfangTCMHospital,Langfang,Hebei, 065000;

4.SpecialHospitalWard,Peoples′HospitalofLangfangCity,Langfang,Hebei, 065000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the potential mechanism of bicyclol in the treatment of rats with chronic alcoholic liver disease (ALD). MethodsA total of 72 SD rats with chronic ALD were randomly divided into control group, model group and intervention group, 24 cases for each group. Model group and intervention group were gavaged with white wine to establish ALD models, after which intervention group was gavaged with bicyclol 200 mg/(kg·d) from the fourth week, for continuously 4 weeks, while control group was given isometric normal saline. ResultsLivers in model group showed aggressive hepatocyte injury, necrosis and fatty degeneration, and the severity of liver lesion was less in intervention group after treatment than that in model group. The liver glutathione (GSH) content and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) activity were evidently lower in model group after 6 and 8 weeks than in control group (P<0.05 orP<0.01). Intervention group was markedly lower than control group but higher than model group in GSH content after 6-week treatment (P<0.05), and was obviously higher in GSH content and alcohol dehydrogenase (ADH) and ALDH activities than model group after 8-week treatment (P<0.05). 6 weeks after treatment, model group was markedly higher than control group in serum alanine transaminase (ALT), cholesterol (TG), triglyceride (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) levels (P<0.05 orP<0.01), and intervention group was apparently lower than model group in TG level (P<0.01). 8 weeks after treatment, there were significant differences between model group and control group in the levels of all serum indexes (P<0.05), so did the differences between model group and intervention group (P<0.05 orP<0.01). ConclusionBicyclol can effectively inhibit the accumulation of ALD-induced liver fat and has favorable protective function on alcohol-induced injury of hepatic tissues, hepatocyte structure and hepatic function.

KEYWORDS:bicyclol; chronic alcoholic liver disease; hepatocyte; fatty degeneration

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11522940)

收稿日期:2015-01-16

中圖分類號:R 575

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)15-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201515001