肺癌患者唾液中細菌構成分析

俞小衛, 楊明夏, 鄭建洲, 高瑞辰,

賀　琛1, 鄢新民2, 龐　勝2

(1. 江蘇省常州市第二人民醫院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003; 2. 美國加州大學洛杉磯分校醫學院)

肺癌患者唾液中細菌構成分析

俞小衛1, 楊明夏1, 鄭建洲1, 高瑞辰1,

賀琛1, 鄢新民2, 龐勝2

(1. 江蘇省常州市第二人民醫院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003; 2. 美國加州大學洛杉磯分校醫學院)

摘要:目的探討唾液中細菌構成與肺癌的關系。方法收集鱗癌和腺癌以及非腫瘤對照組唾液標本，每組10例。對唾液中大量的16 s rDNA進行測序分析。結果經定量PCR(qPCR)證實，5個細菌集群在癌癥和對照組樣本間有顯著差異。結論16 s測序和PCR相結合的研究顯示，有兩個細菌屬(二氧化碳噬纖維菌屬和韋永氏球菌屬)水平癌癥組要顯著高于非癌癥組。

關鍵詞:肺癌; 16 s rDNA測序; 二氧化碳噬纖維菌屬; 韋永氏球菌屬; 唾液微生物群

肺癌5年存活率約11%[1],在北美和全球范圍是癌癥相關死亡最常見原因[2-3]。吸煙被認為是肺癌的一個重要病因，原因是煙草中含有可能會誘發細胞轉換的致癌物質[4]。然而,有報告表明肺癌涉及免疫應答[5]、病毒性感染[6]以及其他與煙草不相關的因素[6-7]。最近的研究[8-13]報告唾液菌群與幾種癌癥有關。先前的報道[14-15]表明衣原體感染與肺癌有關。大多數唾液細菌來自口腔,有些也可能來自食道和上呼吸道。口腔里的細菌生存和發展依賴于口腔環境，而口腔環境可以受到飲食、蛋白質或唾液中其他營養物質、痰液的成分以及習慣譬如吸煙的影響。這些因素與肺癌的發生和發展有關。基于這些考慮，以及之前報道的細菌參與肺癌中腫瘤發生[14-16], 作者調查了肺癌患者的唾液細菌水平。作者使用Illumina公司HiSeq 2000, 通過測序16 s rDNA的V3和V6來量化肺癌和對照組唾液樣本中菌群組成。這種方法可以識別超過500種流行的人類細菌種類和高達每樣本100 000細菌序列。這種高靈敏度和綜合分析提供一種新的方法來研究肺癌和細菌組成之間的關系。

非小細胞肺癌(NSCLC)在肺癌中所占比例超過80%，其中絕大多數是鱗狀細胞癌(SCC, 30%～35%)或腺癌(AC～50%)。在第一輪的研究中,作者選擇鱗癌或腺癌患者和非腫瘤對照組，每組10個樣本，確定了能證明肺癌患者和非腫瘤對照組之間存在顯著差異的細菌綱/屬。隨后作者使用qPCR量化豐富的細菌群證實了這些結果。在第二輪的研究中,所選的細菌集群被用來研究新的一群患者樣本，進一步評估這些細菌集群和肺癌之間的關系。

1材料與方法

1.1　唾液樣本收集

唾液樣本收集是根據常州第二人民醫院(CSPH)倫理委員會批準的協議。所有對象的招募皆來自常州市第二人民醫院。因為吸煙可能影響口腔里細菌的增長,只有有著10年以上吸煙史的受試者被選擇。唾液樣本采集是在癌癥診斷之后和治療之前。沒有一個對象，包括病人和對照者，證明有與唾液細菌相關的其他疾病，譬如糖尿病、免疫功能紊亂、皰疹病毒感染、口腔黏膜潰瘍。患者信息見表1。

表1　肺癌和非癌癥對照組唾液樣本比較

年齡在兩癌癥組間及每癌癥組與對照組間無顯著差異。

1.2　唾液樣本菌群的測序分析

唾液中DNA含量通過SDS溶菌、苯酚萃取去除唾液中蛋白質后被分離。乙醇沉淀恢復樣本中的DNA，其含量通過PCR擴增,正如前面所描述的[17]。作者利用IlluminaHiSeq2000對擴增的樣本進行測序，并對16 s rDNA的V3和V6 進行分析。為確保高質量的數據,作者采用嚴格的條件來處理樣本序列,并因此能夠產生有效的結果。按以下操作步驟進行: ① 所有讀數通過允許一個不匹配的樣本條形碼和兩個不匹配相鄰PCR引物被分配給對應的樣本; ② 讀數隨后通過PyroNoise算法消除干擾[18]; ③ 讀數包含模糊的核苷酸或一個被移除超過8個堿基對(bp)的均聚物，是序列短于200個bp或超過1 000個bp; ④ 這些讀數使用最近的空間終止對齊方式對齊(NAST)，基于序列同步自定義，基于席爾瓦對齊參考[19], 并將沒有預期的對齊參考比對區域的序列丟棄; ⑤ 通過UCHIME算法確定的嵌合序列被移除[20]; ⑥ 讀數通過貝葉斯分類法和核糖體數據庫項目(RDP)進行分類。線粒體序列或未知(這些數據不能在國家級水平上分類)被移除。最后，所有有效的讀數聚集到操作分類單位(OTUs)，基于97%序列相似性，使用MOTHUR程序[21]。樣本在不同分類水平的分類分析(門、綱、目、科、屬)通過使用QIIME被創建[22]。任何指定的綱/屬的水平被算作序列獲得總額的百分比。

定量聚合酶鏈反應:從發現階段細菌測序所確定細菌集群將被qPCR進一步檢測。具體檢測16 s rDNA PCR引物的設計(表2)。引物是選擇從先前出版的文獻[23]或通過搜索RDP數據庫。

表2　16S rDNA定量PCR引物

用于qPCR寡核苷酸引物: F, forward PCR primers;

R, reverse PCR primers。

1.3　統計血分析

根據已發表的文獻[24-29],作者使用接收機操作特征(ROC)曲線分析,這是MedCalc提供的軟件包(MedCalc Software, Acacialaan 22, B-8400 Ostend, Belgium)。為了更好的呈現數據,線的顏色和厚度和字體的大小修改。

2結果

2.1　肺癌患者與非腫瘤對照組間不同唾液微生物剖面圖

基于作者的測序結果,一個類桿菌綱和4個細菌屬(奈瑟氏菌屬, 二氧化碳噬纖維菌屬, 月形單胞菌屬和韋永氏球菌屬)在腫瘤和非腫瘤病人之間具有顯著差異(P<0.05)。類桿菌屬和奈瑟氏菌屬在癌癥患者的水平低于非腫瘤對照組，而二氧化碳噬纖維菌屬, 月形單胞菌屬和韋永氏球菌屬水平高于非腫瘤對照組。

2.2　細菌定量PCR檢測

作者采用qPCR來量化所選擇細菌綱/屬的水平。利用可以擴增大多數細菌16 s rDNA 一對PCR引物標準化癌癥和對照組rDNA水平。qPCR結果與測序結果比較，癌癥樣本的qPCR顯示二氧化碳噬纖維菌屬和韋永氏球菌屬的水平顯著增高，而類桿菌屬和奈瑟氏菌屬水平較低， 支持使用qPCR量化所選擇細菌集群水平的可行性。月形單胞菌屬的水平在一些標本中沒有被檢測到，所以作者從進一步qPCR研究剔除了這個細菌生物標志物。qPCR的總體結果跟測序研究結果類似。

經16 s rDNA定量PCR而確定。因此, 作者反復qPCR來評估實驗之間的變化，每組包含20個數據點(樣標100倍)

2.3　利用所選擇細菌生物標志物對標本量化

評估選擇的細菌集群,作者使用qPCR量化附加的樣本,包括41個癌癥樣本(13 SCC，28 AC)和15個非腫瘤對照。作者使用qPCR量化類桿菌屬和奈瑟氏菌屬、二氧化碳噬纖維菌屬、韋永氏球菌屬水平。這些附加的樣本的結果表明二氧化碳噬纖維菌屬和韋永氏球菌屬癌癥患者的鱗癌和腺癌亞型水平顯著增高，與作者先前30例樣本分析一致。

然而，類桿菌屬和奈瑟氏菌屬 并沒有象在第一輪研究中 那么顯著增高。雖然在非癌癥對照組中奈瑟氏菌屬的水平明顯高于那些腺癌患者,ROC曲線下面積(AUC)值為0.77, 但非腫瘤對照組跟鱗癌比較沒有顯著差異,AUC低于0.70。對于類桿菌屬,通過比較鱗狀細胞癌、腺癌患者與非腫瘤患者樣本所獲得的AUC值小于0.70, 提示二氧化碳噬纖維菌屬和韋永氏球菌屬與肺癌有關，而類桿菌屬和奈瑟氏菌屬可能需要更多的研究來說明這兩個細菌集群是否與肺癌有關。

3討論

作者集中的測序證明類桿菌屬和四個菌屬(奈瑟氏菌屬, 二氧化碳噬纖維菌屬, 月形單胞菌屬和韋永氏球菌屬)水平肺癌和非腫瘤對照樣本中顯著不同。基于這些結果,作者進行第二輪的研究,這些結果表明,至少五個細菌集群中有二個, 二氧化碳噬纖維菌屬和韋永氏球菌屬，其水平癌癥患者的唾液樣本顯著高于非癌癥的對照組。

唾液微生物群與肺癌之間的內在關系正處在調查中。細菌產生的毒素可以干擾細胞周期,從而改變細胞生長[15, 30-31]。這是由于改變的基因控制正常細胞分裂和凋亡[32-33]。對肺癌特定細菌群水平較高的另一種解釋是與肺癌相關的飲食可能會偏愛一些細菌，而抑制一些其他細菌。因此,唾液中細菌組成的模式可能間接與肺癌有關。正如前面報道的,大豆和茶抑制肺癌的風險[34-36]和癌癥進展[37], 而紅肉會增加肺癌的風險[38], 提示飲食與肺癌的發生有關。

由于飲食也與口腔細菌組成有關[39]，菌群在一定程度上可能反映肺癌的風險。唾液微生物群也可能通過誘導長期免疫反應影響肺部細胞。眾所周知,腸道微生物群由于免疫耐受的破壞參與炎癥性腸病(IBD)的發病機制[40]。

作者注意到鱗癌和腺癌之間有著不同。鱗癌樣本中韋永氏球菌屬水平要高于腺癌樣本中(圖1 e、2 d、3 d)，當與非癌癥對照組樣本比較，證明存在顯著的差異。小韋榮氏球菌是從肺癌患者下呼吸道分離出來的細菌，提示這一屬跟肺癌有關[41]。然而,這一屬在肺癌發生發展的發生中精確的作用還不清楚。

二氧化碳噬纖維菌種通常在口咽道發現，該菌種已報道參與肺癌，因為他們已經被證明參與肺膿腫形成[42]和下呼吸道感染[43]，表明癌癥增長偏愛這些細菌的生長。Neisseria在癌癥患者被發現其水平顯著低于二氧化碳噬纖維菌屬和韋永氏球菌屬。胰腺癌樣本中也發現了相似的結果[12]，表明奈瑟氏菌屬可以抑制癌細胞。一個眾所周知的例子是使用卡介苗(BCG)對膀胱癌治療[44]。

關于吸煙,所有的受試者在這項研究中已經抽了10年了。盡管患者集中的一個城市,超過一半的人從許多不同的地方搬到常州。因此,作者認為在此描述的細菌集群是全球分布的。然而,正如前面所報道的，唾液細菌也與飲食有關[39], 因為來自不同地區的人有著不同的飲食，有必要擴大研究來說明不同種族,宗教,或飲食限制中飲食所產生的影響。

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Analysis in saliva bacterial composition

in patients with lung cancer

YU Xiaowei1, YANG Mingxia1, ZHENG Jianzhou1, GAO Ruichen1,

HE Chen1, YAN Xinmin2, PANG Shen2

(1.DepartmentofRespiratory,ChangzhouSecondPeople′sHospital,Changzhou,Jiangsu, 213003;

2.DepartmentofOrthopaedicSurgeryandtheOrthopaedicHospitalResearchCenter,

DavidGeffenSchoolofMedicineatUniversityofCalifornia,LosAngeles,USA, 90095)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the relationship between saliva bacteria composition and lung cancer. MethodsSalivary samples were collected in squamous cell carcinoma, adenocarcinoma and normal people without tumors, 10 cases for each group. Extensive 16S rDNA sequencing was analyzed. ResultsBy quantitative PCR (qPCR), there were significant differences between five bacterial clusters and control samples. ConclusionThe combination of the 16S sequencing study and the PCR study reveal that the levels of two bacterial genera (capnocytophaga and veillonella) are significantly higher in the saliva samples than those in people without cancer.

KEYWORDS:lung cancer; 16S rDNA sequencing; capnocytophaga; veillonella; saliva microbiota

通信作者:龐勝, E-mail: spang@ucla.edu

基金項目:江蘇省常州市中外合作科技基金(CZ20110021)

收稿日期:2014-12-16

中圖分類號:R 734.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)15-029-05

DOI:10.7619/jcmp.201515009