實(shí)時(shí)熒光定量PCR在兒童肺炎支原體感染中的診斷價(jià)值

王　晶, 甘軼文, 毛李征, 俞海國

(1. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院 兒科, 江蘇 南京, 211102;

2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在兒童肺炎支原體感染中的診斷價(jià)值

王晶1, 甘軼文1, 毛李征1, 俞海國2

(1. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院 兒科, 江蘇 南京, 211102;

2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

摘要:目的探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTFQ-PCR)在兒童肺炎支原體(MP)感染中的診斷價(jià)值。方法選取106例肺炎患兒，采集靜脈血，以間接熒光免疫法(IFA)檢測MP-IgM表達(dá)；采集咽拭子標(biāo)本，以RTFQ-PCR檢測MP DNA拷貝數(shù)。以血清學(xué)檢測結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察RTFQ-PCR診斷MP的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，及其在檢測不同年齡段患兒MP感染中的準(zhǔn)確性；比較MP-IgM陽性和陰性患兒的MP-DNA拷貝數(shù)差異。結(jié)果① RTFQ-PCR診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為90.48%、93.02%、95.00%、89.96%。繪制受試者工作曲線(ROC曲線)，曲線下面積為0.740; ② RTFQ-PCR診斷6歲以上患兒MP感染的靈敏度和準(zhǔn)確率高于1歲以下患兒(P<0.01); ③ MP-IgM陽性組DNA拷貝數(shù)對數(shù)顯著高于陰性組拷貝數(shù)對數(shù)(P<0.01)。結(jié)論RTFQ-PCR診斷兒童MP感染具有較好的準(zhǔn)確性，其熒光拷貝數(shù)越大越支持MP感染的診斷，對發(fā)病早期及年齡較大的患兒可能具有更高的診斷價(jià)值。

關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 兒童; 肺炎支原體; 抗體

肺炎支原體(MP)是急性呼吸道感染的常見病原體，尤其是兒童肺炎的常見病原體[1]，10%～30%的兒童社區(qū)獲得性肺炎由MP引起，但在MP感染的肺炎與其他病原微生物感染的肺炎在癥狀、體征等臨床特征方面并無特異性差異[2-3]，難以早期、及時(shí)診斷，往往導(dǎo)致臨床治療中抗生素的濫用。直接檢出病原體是診斷MP的金指標(biāo)，但MP生長緩慢，分離培養(yǎng)條件較高，且培養(yǎng)耗時(shí)較長，臨床應(yīng)用收到諸多限制[4]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTFQ-PCR)可快速檢測咽拭子標(biāo)本中的MP-DNA，近年來在MP所致肺炎的診斷中得到了廣泛應(yīng)用[5]。本研究探討了RTFQ-PCR檢測肺炎患兒MP感染的準(zhǔn)確度、特異度等，以期為臨床診斷兒童MP感染提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

選取2012年1月—2014年12月在東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院治療的肺炎患兒106例，均以咳嗽、發(fā)熱為主要癥狀，胸片示片狀陰影等肺炎特征，排除最近3 d內(nèi)應(yīng)用過大環(huán)內(nèi)酯類藥物的患兒[6]。其中男35例，女32例；年齡5個(gè)月～12歲，平均(5.24±1.48)歲；1歲以下24例，1～6歲44例，6歲以上38例。

1.2　方法

患兒均于入組時(shí)采集咽拭子標(biāo)本，浸于1 mL無菌生理鹽水中震蕩，密封后-20 ℃冰箱保存，用以RTFQ-PCR檢測MP DNA拷貝數(shù)，試劑盒購自通派(上海)生物科技有限公司。入組時(shí)采集靜脈血，以間接熒光免疫法(IFA)檢測MP-IgM表達(dá)。

1.3　觀察指標(biāo)

① 以IFA血清學(xué)檢測結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，即雙份血清MP抗體滴度升高4倍以上，或單份血清MP-IgM抗體陽性，且滴度≥1∶80診斷為MP感染，觀察RTFQ-PCR診斷MMP的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，以及在檢測不同年齡段患兒MP感染中的準(zhǔn)確性。靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%, 特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%, 陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%; ② 比較MP-IgM陽性和陰性患兒的MP-DNA拷貝數(shù)差異。

2結(jié)果

2.1　RTFQ-PCR診斷結(jié)果

106例肺炎患兒中，IFA法檢測出MP-IgM陽性63例，陰性43例；RTFQ-PCR檢測出陽性60例(真陽性57例，假陽性3例)，陰性46例(真陰性40例，假陰性6例)。以IFA檢測結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，RTFQ-PCR診斷靈敏度為90.48%(57/63), 特異度為93.02%(40/43), 陽性預(yù)測值為95.00%(57/60)，陰性預(yù)測值為86.96%(40/46)。

2.2　ROC下面積評價(jià)RTFQ-PCR對MPP的診斷價(jià)值

繪制ROC曲線, AUC=0.740, 表明RTFQ-PCR對MPP具有較好的診斷準(zhǔn)確性。

2.3　RTFQ-PCR檢測不同年齡段患兒MP感染的結(jié)果

RTFQ-PCR檢測不同年齡段患兒MP感染的結(jié)果見表1，其中1歲以下診斷靈敏度為33.33%(2/6)，特異度為77.78%(14/18), 準(zhǔn)確率為66.67%(16/24); 1～6歲診斷靈敏度為96.00%(24/25), 特異度為94.73%(18/19), 準(zhǔn)確率為95.45%(42/44); 6歲以上診斷靈敏度為100.00%(31/31), 特異度為85.71%(6/7), 準(zhǔn)確率為97.37%(37/38)。3組比較，1～6歲和6歲以上患兒的診斷靈敏度及準(zhǔn)確率均高于1歲以下患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但1～6歲和6歲以上患兒之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　RTFQ-PCR檢測不同年齡段患兒MP感染的

2.4　MP-IgM陽性和陰性患兒MP-DNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)血清學(xué)檢測結(jié)果，將106例患兒分為MP-IgM陽性組和陰性組，分別對其PCR拷貝數(shù)取對數(shù)后進(jìn)行比較，陽性組拷貝數(shù)對數(shù)為(5.78±2.03)log(MP-DNA)copy/mL, 陰性組拷貝數(shù)對數(shù)為(4.12±1.54)log(MP-DNA)copy/mL, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3討論

MP是兒童呼吸道感染的常見病原體，病原體培養(yǎng)是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但MP培養(yǎng)較困難，結(jié)果判定耗時(shí)需3～4周，因此，血清學(xué)MP抗體檢測是目前臨床應(yīng)用的主要診斷方法[7-8]，而在各抗體亞型中，只有IgM能提示早期感染[9]，但MP-IgM通常出現(xiàn)于發(fā)病后1周，診斷依然存在延后性；且對免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的新生兒或存在免疫缺陷的患兒，血清學(xué)診斷方法存在一定局限性。

RTFQ-PCR是近年來被廣泛應(yīng)用的核酸檢測技術(shù)，其在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上增加了能識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的探針，并以熒光標(biāo)記，通過計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)描計(jì)產(chǎn)物擴(kuò)增過程中的熒光曲線，并換算成DNA拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量的目標(biāo)。RTFQ-PCR操作方便，短時(shí)間內(nèi)即可出結(jié)果，可顯著減少擴(kuò)增產(chǎn)物的污染機(jī)會(huì)，從而降低假陽性發(fā)生率，在成人和兒童MP感染的診斷中具有較大應(yīng)用價(jià)值[10]。袁藝等[11]報(bào)道，在病程第1周，RTFQ-PCR診斷MP的敏感度和特異度分別為92.70%和93.3%，高于血清學(xué)檢測，但隨著病程的延長，血清學(xué)檢測的敏感度顯著升高，因此認(rèn)為RTFQ-PCR更適合MPP的早期快速診斷。楊勇瓊[12]也報(bào)道，社區(qū)活動(dòng)性肺炎患者入院第1天，采用RTFQ-PCR的診斷率高于血清學(xué)診斷。樊茂等[13]對比了RTFQ-PCR和IFA檢測小兒MP感染的陽性率，結(jié)果表明2種方法各有利弊，聯(lián)合應(yīng)用可提高早期檢出率。一項(xiàng)納入14篇文獻(xiàn)的系統(tǒng)評價(jià)表明，PCR技術(shù)用于診斷MP感染的ROC曲線下面積>0.7，診斷準(zhǔn)確率較好[14]。本研究結(jié)果表明，RTFQ-PCR檢測兒童MP感染的靈敏度和特異度分別為90.47%和93.02%，繪制ROC曲線計(jì)算AUC為0.740, 高于張曉波等[15]報(bào)道的AUC(0.641); 比較不同年齡段患兒的檢出率，結(jié)果表明6歲以上患兒的診斷靈敏度高于1歲以下患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 6歲以上患兒的診斷準(zhǔn)確率高于其他年齡段患兒，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 這可能與樣本量較小有關(guān)。此外，MP-IgM陽性組DNA拷貝數(shù)顯著高于陰性組DNA拷貝數(shù)，提示RTFQ-PCR檢測為陽性的時(shí)間可能較血清學(xué)抗體檢測出現(xiàn)陽性更早，PCR拷貝數(shù)越大越能支持診斷結(jié)果。因此，對高度懷疑MP感染的患兒，在發(fā)病早期即可行RTFQ-PCR檢測，結(jié)果為陽性且拷貝數(shù)較大的患兒，可在發(fā)病1周后進(jìn)一步檢測血清抗體，提高診斷準(zhǔn)確率。

參考文獻(xiàn)

[1]陳志敏. 兒童肺炎支原體感染診治研究進(jìn)展[J]. 臨床兒科雜志, 2008, 26(7): 562.

[2]Youn Y S, Lee K Y. Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children[J]. Korean journal of pediatrics, 2012, 55(2): 42.

[3]Wang K, Gill P, Perera R, et al. Clinical symptoms and signs for the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in children and adolescents with community-acquired pneumonia[J]. The Cochrane Library, 2012, doi: 10.1002/14651858.CD009175.pub2.

[4]董燕芬, 馬玲娣. 肺炎支原體檢測及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 31(3): 269.

[5]Thurman K A, Warner A K, Cowart K C, et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, and Legionella spp. in clinical specimens using a single-tube multiplex real-time PCR assay[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2011, 70(1): 1.

[6]Yamada M, Buller R, Bledsoe S, et al. Rising rates of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae in the central United States[J]. Pediatr Infect Dis J, 2012, 31(4): 409.

[7]Smith-Norowitz T A, Silverberg J I, Kusonruksa M, et al. Asthmatic Children Have Increased Specific Anti-Mycoplasma pneumoniae IgM but not IgG or IgE—Values Independent of History of Respiratory Tract Infection[J]. Pediatr Infect Dis J, 2013, 32(6): 599.

[8]Lee K, Kim W J, Kim D L, et al. Seroprevalences of Mycoplasma pneumoniae IgM Antibodies among Children Living in Jeju Island, Korea[J]. LMO, 2014, 4(3): 146.

[9]張健, 李莉, 王文龍, 等. 肺炎支原體抗體分型檢測和被動(dòng)顆粒凝集檢測結(jié)果比較[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 35(7): 639.

[10]Qu J, Gu L, Wu J, et al. Accuracy of IgM antibody testing, FQ-PCR and culture in laboratory diagnosis of acute infection by Mycoplasma pneumoniae in adults and adolescents with community-acquired pneumonia[J]. BMC infectious diseases, 2013, 13(1): 172.

[11]袁藝, 伏瑾, 曹玲, 等. 肺炎支原體熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測在兒童肺炎支原體肺炎中的診斷意義[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志, 2009, 24(10): 760.

[12]楊勇瓊. 支原體肺炎早期診斷中熒光定量PCR優(yōu)于血清學(xué)試驗(yàn)[J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥, 2012, 7(29): 3.

[13]樊茂, 張倩. 兩種方法檢測肺炎支原體感染的比較[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(5): 586.

[14]陸愛珍, 王立波. PCR技術(shù)用于診斷肺炎支原體感染的系統(tǒng)評價(jià)[J]. 臨床兒科雜志, 2007, 25(4): 312.

[15]張曉波, 陸愛珍, 王立渡, 等. 肺炎支原體熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在肺炎支原體感染中的診斷評價(jià)[J]. 中華兒科雜志, 2008, 46(6): 442.

技術(shù)與方法

The diagnostic value of real-time PCR in children with

mycoplasma pneumoniae infection

WANG Jing1, GAN Yiwen1, MAO Lizheng1, YU Haiguo2

(1.DepartmentOfPediatrics,NanjingTongrenHospitalAffiliatedtoMedicalSchool

ofSoutheastUniversity,Nanjing,Jiangsu, 211102; 2.DepartmentofRheumatology,

NanjingChildren′SHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210008)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the diagnostic value of real-time quantitative PCR (RTFQ-PCR) in children with mycoplasma pneumoniae (MP) infection. MethodsTotally 106 children with pneumonia were choosed and venous blood was collected. Indirect fluorescence immunoassay (IFA) were applied to detected MP-IgM expression. RTFQ-PCR was used to determine the MP DNA copies collected from throat swab specimens. Diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of RTFQ-PCR as well as detection accuracy among different ages were observed according to diagnostic criteria serological test. Meanwhile the differences of MP-DNA copies between MP-IgM positive and negative children was compared. Results① Diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of RTFQ-PCR were 90.48%, 93.02%, 95.00%, 89.96% respectively. Receiver operating characteristic curve was analysed and the area under the curve was 0.740. ② Sensitivity and accuracy of RTFQ-PCR in MP children over 6 years old were higher than in children under 12 months (P<0.01). ③ Logarithm of DNA copies in MP-IgM positive children was significantly higher than that in MP-IgM negtive children (P<0.01). ConclusionRTFQ-PCR diagnosis of MP infection in children has a favorite accuracy. The greater the fluorescent of copies are, the support with the diagnosis of MP infection goes up. It may have a higher diagnostic value in early onset and older children.

KEYWORDS:mycoplasma pneumonia; real-time quantitative PCR; children; antibody

通信作者:毛李征, E-mail: maolz@njtrh.org

收稿日期:2015-04-03

中圖分類號:R 563.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)15-091-03

DOI:10.7619/jcmp.201515027