G-CSF 對局灶腦缺血再灌注大鼠脂質過氧化及神經細胞凋亡的影響

龔筱弦，范 佳，付希佳，趙 陽，宋 磊

缺血性腦血管疾病是當今世界最常見疾病之一，致死、致殘率非常高且一直缺乏有效的治療手段。及時增加或恢復梗死區域的血流、保護缺血缺氧的神經細胞是目前最常用的臨床治療方法。然而人為干預或自發的再灌注卻會使缺血所致的神經細胞損傷和神經功能缺損進一步加重，給缺血性卒中的治療帶來新的難題。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是體內一種多肽鏈的細胞生長因子，可特異地調節粒系細胞的增殖和分化，并能增強成熟粒細胞的功能，對機體防御應激或損傷有重要意義［1］。最新研究表明G-CSF 還可以對缺血再灌注神經元起到保護作用。G-CSF 神經保護作用機制復雜，目前認為其可能的機制主要有抗凋亡、促進內源性干細胞遷徙增殖及分化、抗炎以及促進血管生成等［2，3］。但至今其抗凋亡機制尚未完全闡明，也沒有G-CSF 對缺血再灌注后自由基和脂質過氧化影響的相關研究與報道。

基于以上事實，本研究以缺血再灌注大鼠為模型，研究G-CSF 對體內脂質過氧化及神經細胞凋亡的影響，初步探討其可能的抗凋亡機制及抗自由基作用，為缺血性腦卒中提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性Wistar 大鼠24 只，體重250～300 g，由吉林大學動物實驗中心提供。動物許可證號:SCXK(吉)2003-0002。隨機分成3 組:假手術組、對照組、G-CSF 治療組。GCSF 治療組于再灌注后2 h 后經皮下按50 μg/kg 比例一次性注射粒細胞集落刺激因子;鹽水對照組注入等量生理鹽水;假手術組尼龍魚線插入僅10 mm，未阻斷血流，其余步驟同手術組，手術后不作任何干預性措施。

1.2 主要試劑 重組粒細胞集落刺激因子購自長春金賽藥業有限責任公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和丙二醛(Malonaldehyde，MDA)測試盒試劑盒購自南京建成生物工程研究所，磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogenactivated protein kinases，p-p38 MAPK)和磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)抗體購自Cell Signaling 公司，轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 缺血再灌注大鼠模型的制備 大鼠術前禁食12 h，10%水合氯醛(3.5 ml/100 g 體重)腹腔注射麻醉，固定于手術臺，備皮常規消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，在手術顯微鏡下相繼暴露、分離右頸總動脈(common carotid artery，CCA)主干及分叉、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，結扎并離段頸外動脈。用微動脈夾暫時夾閉CCA 主干近端和ICA 遠端，在頸內動脈近端備線，在ECA 近CCA 分叉3～5 mm 處剪一小口，將栓線插入，輕推尼龍線尾端經ICA 入顱，阻力感比較明顯時停止插入，此時栓線準確到達大腦前動脈起始段，栓線將阻斷進入大腦中動脈的血流，引起局灶性腦缺血改變;結扎ICA 備線，取掉微動脈夾;消毒棉球清潔手術野，逐層縫合;青霉素鈉鹽40000 U 腹腔注射，預防術后感染。1.5 h 后行再灌注，剪開縫合線，拔除栓線，縫合切口。共使用24 只大鼠，模型神經系統評分采用Longa 評分法:無神經功能缺損癥狀為0 分;提尾向下，不能完全伸展右側前爪為1 分;行走時向右側轉圈為2 分;行走時向右側傾倒，行走困難為3 分;不能自發行走且意識水平下降為4 分;死亡為5 分。評分1～3 分為成功動物模型。

1.3.2 大鼠處死取材 再灌注24 h 后各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，以生理鹽水經升主動脈灌注固定腦組織，0 ℃～4 ℃條件下快速斷頭取腦，取右側少量海馬組織稱重后，應用冰冷的生理鹽水制備成10%組織勻漿置-40 ℃待測。余腦組織浸泡于4%多聚甲醛緩沖液24 h，用于病理觀察及免疫組化檢測。

1.3.3 脂質過氧化指標的測定 根據南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書進行腦組織中SOD、GSH-Px、MDA 和NO 的測定和計算。簡單步驟如下:(1)空白管中加入0.1 ml 的雙蒸水;標準管中加入0.1 ml 的標準應用液(100 μmol/L);測定管中加入10%腦組織勻漿0.1 ml。再于各管中加入試劑1:0.2 ml;試劑2:0.2 ml。混勻，37 ℃水浴60 min。(2)各管中再分別加入試劑3:0.2 ml;試劑4:0.1 ml。充分旋渦混勻30 s，室溫靜置10 min，離心10 min(3500 r/min)，取上清顯色。(3)各管中再加入上清液0.5 ml，顯色劑0.6 ml。混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調零，550 nm，1 cm 光徑，測各管OD 值。

計算公式:目標物質含量(μmol/mgport)=(測定管OD 值-空白管OD 值)÷(標準管OD 值-空白管OD 值)×標準品濃度÷樣本的蛋白含量。

1.3.4 p38MAPK/JNK 免疫組化染色 取大鼠腦石蠟切片烤片、水化。經抗原修復后，每張切片加1 滴或50 μl 過氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10 min，1 ×PBS 沖洗后血清封閉。除去血清，每張切片加1 滴1∶ 200 稀釋的一抗(p38MAPK/JNK 抗體)，4 ℃過夜。1 ×PBS 沖洗后每張切片加1 滴1∶1000 稀釋的生物素標記二抗，室溫下孵育10 min，1×PBS 沖洗。每張切片加1 滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min。每張切片加2滴或100 μl 新鮮配制的DAB 溶液，自來水沖洗，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封固。光學顯微鏡下(400 倍)每只大鼠切片選取大致相同部位5 個視野，數碼相機拍照并計數陽性細胞數。

1.3.5 Tunel 染色測定神經細胞凋亡 按照羅氏公司TUNEL 細胞凋亡檢測程序行染色，具體過程如下:石蠟切片烤片、脫蠟后用Proteinase K 工作液處理組織(15～30 min，21 ℃～37 ℃)。再用PBS漂洗兩次，加入制備TUNEL 反應混合液，孵育1 h后PBS 漂洗3 次，待玻片干后加50 μl converter-POD 于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中反應(37 ℃，30 min)。PBS 漂洗3 次，在組織處加50～100 μl DAB 底物，反應15 ℃～25℃×10 min。PBS 漂洗3次后再用蘇木素復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS 或甘油在視野下，光學顯微鏡下(400 倍)每只大鼠切片選取大致相同部位5 個視野，數碼相機拍照并計數陽性細胞數。

2 結果

2.1 tMCAO 的建立及分組情況 使用了18只大鼠建立腦缺血再灌注模型，其中2 只于術后第1 天因蛛網膜下腔出血死亡，其余存活的16 只大鼠中，共15 例出現較為明顯的神經功能損害，手術成功率為83.3%。共使用6 只大鼠建立假手術模型，術后6 只大鼠均存活。隨機分組后，對照組7 只大鼠，神經系統評分:2.5 ±1.1;G-CSF 治療組8 只大鼠，神經系統評分:2.6 ±0.9，兩組間無顯著性差異，肢體運動功能損害的模型在各組分布相對均衡。假手術組6 只假手術模型大鼠神經系統評分為0 分。

2.2 再灌注區域SOD、GSH-Px 活性 與鹽水對照組相比，G-CSF 治療組SOD、GSH-PX 活性均顯著性升高(P ＜0.05)，但均低于假手術組(P ＜0.01)(見表1)。

2.3 再灌注區域MDA、NO 含量 與鹽水對照組相比，G-CSF 治療組MDA、NO 水平均顯著性降低(P ＜0.05)，但均高于假手術組(P ＜0.01)(見表2)。

2.4 再灌注區域p-p38MAPK 及p-JNK 陽性細胞 假手術組p-p38MAPK 及p-JNK 均無明顯表達，缺血再灌注后24 h，在鹽水對照組大鼠缺血區皮質及周圍區域即有p38MAPK 及JNK 大量磷酸化表達。治療組相比于對照組，陽性染色細胞數明顯減少，并具有統計學意義(P ＜0.01)(見表3)。

2.5 Tunel 染色計數凋亡細胞 假手術組未見明顯凋亡細胞。缺血再灌注后24 h，在鹽水對照組大鼠缺血皮質及海馬均可見大量凋亡細胞。凋亡細胞表現為細胞核固縮，胞體縮小，核膜皺縮，染色質濃集于核膜附近，核內出現棕黃色顆粒和不規則固縮團塊，濃染呈棕褐色。治療組缺血區域凋亡神經細胞數較對照組明顯減少(見表4)。

表1 各組SOD 和GSH-PX 活性比較()

表1 各組SOD 和GSH-PX 活性比較()

表2 各組MDA 和NO 含量比較()

表2 各組MDA 和NO 含量比較()

表3 各組p-p38MAPK 和p-JNK 陽性細胞數比較()

表3 各組p-p38MAPK 和p-JNK 陽性細胞數比較()

表4 各組TUNEL 法檢測細胞凋亡數()

表4 各組TUNEL 法檢測細胞凋亡數()

3 討論

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是抗氧化酶系統中最重要的成員，與抗氧化劑如輔酶Q、VitE 等共同作用，使自由基產生與清除兩方面處于動態平衡。但發生缺血再灌注時氧自由基大量生成，體內抗氧化系統不足以清除過多產生氧自由基造成初始缺血損傷并不嚴重的神經元損傷或凋亡從而加重神經功能缺損［4，5］。本實驗發現GCSF 可以使抗氧化酶的活性增加，主要表現在治療組大鼠缺血區域SOD 及GSH-PX 水平明顯高于對照組(P ＜0.05)。雖然G-CSF 可以增加治療組大鼠腦內SOD 及GSH-PX 活性，但這種作用是否能夠有效得體現在對抗體內的氧化應激呢?脂質過氧化(lipid peroxidation，LPO)反應是指自由基與不飽和脂肪酸氧化分解成各種代謝產物即過氧化脂質的連鎖反應過程［6］。因此脂質過氧化產物如丙二醛(malondialde-hyde，MDA)、4-羥 基 壬 烯 醛(4-hydroxynonenal，HNE)和丙烯醛的水平間接的反映了體內氧化應激的程度，被認為可以作為衡量氧化應激的生物學指標［7］。在本次實驗中，選取其中最常用的生成期產物MDA 作為測量指標。發現相對于對照組，治療組大鼠腦內MDA 水平明顯下降，充分表明G-CSF 不僅僅是單純增加抗氧化酶的活性，其在體內的抗氧化應激作用也是確切存在的。

本次實驗還測定了3 組大鼠腦內一氧化氮(nitric oxide，NO)的水平。在腦缺血及再灌注損傷中，NO 有著重要的作用。缺血后期由神經細胞中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化產生的NO 則具有神經毒性作用，使腦缺血損傷程度加重［8］。有研究表明，炎癥時G-CSF 可以通過抑制NOS 的表達降低肺泡內皮細胞中NO 的含量［9］，但是否在神經細胞中也有相似作用尚無明確報道。本次研究發現治療組NO 水平明顯低于對照組，說明CSF 同樣可以降低缺血晚期神經細胞中的NO 含量而發揮神經保護作用。

除了被認為是G-CSF 抗凋亡的主要途徑-JAKs-STATs 途徑外，Kamezaki 等人認為G-CSF 還能通過其他的蛋白酪氨酸激酶如胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等 發 揮 作用［10］。ERK 是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族中的一員。MAPK 超家族廣泛分布于細胞漿內，是一族含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是將細胞外刺激信號傳遞到細胞核，引起細胞生物學反應的重要信號傳導系統［11］。除了ERK，MAPK 家族中還包含c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、ERK3/4 和ERK5 等亞家族，被認為參與缺血再灌注損傷中細胞的損傷和修復的調控［12～14］。本次即選取了其中兩個重要的途徑:p38MAPK 途徑和JNK 途徑，進一步研究G-CSF 發揮抗凋亡作用的可能機制。

當腦缺血再灌注后，大量生成的炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白介素1(interleukin 1，IL-1)、過氧化氫、谷氨酸等激活p38MAPK 和JNK 信號通路，生成的活性形式也即磷酸化的p-p38MAPK 和p-JNK，通過激活c-jun蛋白和c-fos 蛋白、誘導bax 蛋白轉位、介導半胱天冬酶(caspases)活化、磷酸化p53 等介導神經細胞的凋亡［15］。關于G-CSF 對缺血再灌注后p38MAPK和p-JNK 途徑的影響，尚未見報道。本次研究中發現G-CSF 治療組大鼠缺血腦組織中p-p38MAPK 和p-JNK 陽性細胞較對照組明顯減少，并有顯著性差異。G-CSF 抗p38MAPK 和p-JNK 途徑介導的細胞凋亡和兩者的抑制劑作用不同，其主要作用是減少p38MAPK 磷酸化，至于是否還可以通過拮抗p38MAPK 下游途徑還有待于進一步研究。另外，p38MAPK 途徑還可以與LPO 反應相互影響，在缺血性腦損傷的發生、發展中起協同作用。Park 等研究發現用p38MAPK 抑制劑可以降低誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性和NO 水平，提示p38MAPK 信號通路參與缺氧介導的NO 生成［16］。因此通過本實驗結果，我們推測拮抗p38MAPK 途徑可能是G-CSF 減少NO 的產生的機制之一。

實驗的最后我們還對所有的大鼠模型進行了tunel 染色以驗證G-CSF 的神經保護作用。發現在治療組大鼠腦內神經細胞凋亡明顯少于對照組。綜上，我們認為G-CSF 可以顯著降低大鼠缺血再灌注后脂質過氧化反應、拮抗JNK 和p38MAPK 途徑，并可能以此為作用機制之一，減輕神經細胞凋亡、改善神經功能缺損。

［1］Shah J，Welsh SJ.The clinical use of granulocyte-colony stimulating factor［J］.Br J Hosp Med(Lond)，2014，75(2):29-32.

［2］Solaroglu I，Digicaylioglu M，Keles GE，et al.New missions for an old agent:granulocyte-colony stimulating factor in the treatment of stroke patients［J］.Curr Med Chem，2015.

［3］Sun BL，He MQ，Han XY，et al.Intranasal delivery of granulocyte colony-stimulating factor enhances its neuroprotective effects against ischemic brain injury in rats［J］.Mol Neurobiol，2014.

［4］Hegstad E，Berg-Johnsen J，and Langmoen IA.Failure of allopurinol to protect against cerebral injury when given after the start of hypoxia［J］.Acta Neurol Scand，1991，83(5):286-288.

［5］Allen CL，Bayraktutan U.Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke［J］.Int J Stroke，2009，4(6):461-470.

［6］Yin H，Xu L，Porter NA.Free radical lipid peroxidation:mechanisms and analysis［J］.Chem Rev，2011，111(10):5944-5972.

［7］Liu L，Zhang K，Sandoval H，et al.Glial lipid droplets and ROS induced by mitochondrial defects promote neurodegeneration［J］.Cell，2015，160(1/2):177-190.

［8］Liu H，Li J，Zhao F，et al.Nitric oxide synthase in hypoxic or ischemic brain injury［J］.Rev Neurosci，2015，26(1):105-117.

［9］Hoffmann G and Schobersberger W.Granulocyte-colony stimulating factor inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression in pulmonary epithelial cells in vitro［J］.Eur J Pharmacol，1998，358(2):169-176.

［10］Kamezaki K，Shimoda K，Numata A，et al.Roles of Stat3 and ERK in G-CSF signaling［J］.Stem Cells，2005，23(2):252-263.

［11］Arthur JS，Ley SC.Mitogen-activated protein kinases in innate immunity［J］.Nat Rev Immunol，2013，13(9):679-692.

［12］Karelina K，Liu Y，Alzate-Correa D，et al.Mitogen and stress-activated kinases 1/2 regulate ischemia-induced hippocampal progenitor cell proliferation and neurogenesis［J］.Neuroscience，2015，285:292-302.

［13］Jiang M，Li J，Peng Q，et al.Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation［J］.J Neuroinflammation，2014，11(1):167.

［14］Cheng YL，Choi Y，Seow WL，et al.Evidence that neuronal Notch-1 promotes JNK/c-Jun activation and cell death following ischemic stress［J］.Brain Res，2014，1586:193-202.

［15］Sawe N，Steinberg G，Zhao H.Dual roles of the MAPK/ERK1/2 cell signaling pathway after stroke［J］.J Neurosci Res，2008，86(8):1659-1669.

［16］Park SY，Lee H，Hur J，et al.Hypoxia induces nitric oxide production in mouse microglia via p38 mitogen-activated protein kinase pathway［J］.Brain Res Mol Brain Res，2002，107(1):9-16.