大鼠GAD65 基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在MSCs 中的表達(dá)

趙元淑，鄧 鎮(zhèn)，陳 麗，周玉波，馬 猛，羅亞楠，胡景鑫，雷水生，朱曉琴

GAD65 是腦內(nèi)GABA(γ-aminobutyric acid，GABA)合成的限速酶。GABA 是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［1］，在正常機(jī)體內(nèi)GABA 和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，Glu)的量在腦內(nèi)保持相對(duì)平衡，當(dāng)神經(jīng)元損傷GAD65 含量降低時(shí)腦內(nèi)GABA 濃度降低可以引起癲癇的發(fā)生。目前細(xì)胞移植法已經(jīng)成為癲癇療法的研究熱點(diǎn)，研究表明將GAD65 基因通過(guò)細(xì)胞移植的方法導(dǎo)入腦內(nèi)可以有效抑制癲癇的發(fā)生［2，3］，但是這些研究中使用的種子細(xì)胞如神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞等由于取材不方便、涉及倫理等問(wèn)題，限制了其在實(shí)驗(yàn)和臨床中的應(yīng)用，因此選擇一種理想的種子細(xì)胞是細(xì)胞移植的根本。骨髓MSCs 在體內(nèi)外具有很強(qiáng)的增殖能力和多分化潛能［4，5］，是一種理想的種子細(xì)胞，為了探討GAD65 基因修飾的MSCs 移植對(duì)癲癇的作用，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建GAD65 的慢病毒載體并感染MSCs，為進(jìn)一步研究細(xì)胞移植后GAD65 基因在腦內(nèi)的表達(dá)及對(duì)癲癇的治療效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 大腸桿菌DH5α、293 T 細(xì)胞、pCDNA3.1-GAD65 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;LV5-GFP 及包裝質(zhì)粒由廣州醫(yī)科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);NotI、Eco31I、DNA 連接酶購(gòu)于Fermentas 公司;DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司;Lipofectamin2000、Opti-MEM 購(gòu)于Invitrogen 公司;胎牛血清、低糖DMEM、胰酶購(gòu)于Gibco;一抗購(gòu)于Abcam，二抗購(gòu)于北京中杉金橋。

1.2 方法

1.2.1 LV5-GAD65 慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定PCR 擴(kuò)增pCDNA3.1-GAD65 中的GAD65 基因片段，根據(jù)Genbank 中GAD65(NM_012563.1)的序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別加上NotI 和Eco31I 及保護(hù)堿基。上游引物5’GATATGCGGCCGCATGGCATCTCCGGGCTCTGGCTTTTGG 3’，下游引物5’CTATCGGTCTCGGATCCTTACAAATCTTGTCCCAGGCGTTC 3’擴(kuò)增片段為1758 bp。PCR 條件為:95℃3 min;94 ℃30 s;55 ℃30 s;72 ℃30 s;30 個(gè)循環(huán)72 ℃5 min。利用Agarose 電泳并切膠回收目的片段。酶切、電泳，用DNA 凝膠回收試劑盒回收GAD65 基因片段和載體LV5。用T4 DNA ligase 連接GAD65 基因片段和線(xiàn)性化的載體。小量抽提質(zhì)粒，送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.2 慢病毒的包裝與滴度測(cè)定 轉(zhuǎn)染前1 d，將293 T 細(xì)胞接種于15 cm 平皿中，37 ℃5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。取1.5 ml Opti-MEM，加入100 μl 的含有穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒的(pGag/pol、pRev、pVSVG、LV5-GFP-GAD65)慢病毒;另取1.5 ml Opti-MEM，加入300 μl Lip2000;將上述兩種液體混合，室溫放置20 min。用上述混合液轉(zhuǎn)染平皿中的細(xì)胞，6 h 后吸除轉(zhuǎn)染液。72 h 收集細(xì)胞上清液，離心過(guò)濾后分裝，-80 ℃冰箱保存。

將293 T 細(xì)胞以3×104濃度接種于96 孔板，各孔加入不同濃度梯度的病毒液100 μl(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，以L(fǎng)V5-GFP 作為對(duì)照組，37 ℃5% CO2培養(yǎng)24 h。72 h 后通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)算熒光數(shù)，并根據(jù)公式TU/μl=(GFP 陽(yáng)性細(xì)胞率×轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋因子計(jì)算出病毒液滴度。

1.2.3 慢病毒感染MSCs 轉(zhuǎn)染前1 d，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MSCs 以5×103接種于96 孔板中，將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞分3 組:A 組:LV5-GFP-GAD65 轉(zhuǎn)染組;B組:空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;C 組:未轉(zhuǎn)染組。次日，將病毒液以MOI 200 感染細(xì)胞，并加入終濃度5 μg/ml 的Polybrene 增加轉(zhuǎn)染率(B 組以同樣方法轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒LV5-GFP，C 組不轉(zhuǎn)染)。24 h 后換液，48 h 觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)情況。通過(guò)嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)感染后GAD65 蛋白的表達(dá) 取病毒感染后2 w 的MSCs，加入裂解液提蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度。取40 μl 蛋白上樣行丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(稀釋至1:2000)4 ℃封閉過(guò)夜，加入二抗(稀釋至1:5000)室溫孵育1 h，ECL 曝光顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用±s 表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LV5-GFP-GAD65 慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建成功的LV5-GAD65 慢病毒載體經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NotI 和Eco31I 酶切電泳鑒定結(jié)果(見(jiàn)圖1)顯示:擴(kuò)增出大小為1 758 bp 的GAD65 基因片段，和大小為9 337 bp 的LV5 基因片段。測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示與Genbank 中GAD65(NM_012563.1)的序列完全一致，無(wú)讀碼框移。LV5-GAD65 慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖2 重組質(zhì)粒LV5-GFP-GAD65 部分測(cè)序圖

2.2 慢病毒包裝與滴度測(cè)定 慢病毒4 種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T 細(xì)胞后，72 h 觀察細(xì)胞熒光表達(dá)。構(gòu)建的質(zhì)粒能夠成功感染293 T 細(xì)胞。根據(jù)病毒滴度計(jì)算公式計(jì)算出濃縮后LV5-GAD65 慢病毒病毒液滴度為5×107TU/ml，空質(zhì)粒LV5 的滴度為7×107TU/ml，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒液滴度的要求。

2.3 慢病毒感染MSCs 病毒液以MOI 300 感染大鼠MSCs，24 h 換液后熒光不是很明亮，感染72 h后熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的綠色熒光，感染率達(dá)到90%以上(見(jiàn)圖3)。

圖3 A:LV5-GFP-GAD65 感染MSCs，可見(jiàn)光;B:LV5-GFPGAD65 感染MSCs，熒光

2.4 Western blot 檢測(cè)MSCs 中GAD65 蛋白的表達(dá) 提取病毒液感染后的各組MSCs 的蛋白，行Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4):LV5-GFPGAD65 轉(zhuǎn)染組過(guò)表達(dá)GAD65 蛋白，而LV5-GFP 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組未檢測(cè)到GAD65 蛋白表達(dá)。說(shuō)明包裝濃縮的病毒液感染間充質(zhì)細(xì)胞后，能夠穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAD65 蛋白。

圖4 Western blot 檢測(cè)MSCs 中GAD65 的表達(dá)

3 討論

顳葉癲癇是目前最難治療的癲癇類(lèi)型之一，主要表現(xiàn)為海馬硬化，抑制癲癇發(fā)作的GABA 能神經(jīng)元數(shù)量大幅度減少，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)失衡從而引起癲癇的發(fā)生［6～8］。細(xì)胞移植作為癲癇的替代療法因其應(yīng)用安全有效越來(lái)越受到重視。骨髓MSCs 是一種來(lái)源于骨髓的非造血前體細(xì)胞，由于其具有向非間充質(zhì)細(xì)胞譜系如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等分化的多向分化的能力而成為治療神經(jīng)損傷的理想種子細(xì)胞［9］;移植MSCs 可以用于治療脊髓損傷、癲癇等疾病［10，11］，但是由于MSCs 在腦內(nèi)分化成為神經(jīng)元需要大概3 w 的時(shí)間［12，13］，而GAD65 基因修飾的MSCs 可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高濃度的GABA［14］，因此移植GAD65 基因修飾的MSCs是治療癲癇的理想選擇。

GAD65 cDNA 全長(zhǎng)1758 bp，編碼585 個(gè)氨基酸，GAD65 在腦組織內(nèi)主要位于神經(jīng)軸突末梢，合成突觸釋放的GABA。本實(shí)驗(yàn)對(duì)GAD65 基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果與Genbank 中序列完全一致，無(wú)堿基突變和讀碼框移。將DNA 導(dǎo)入真核細(xì)胞的方式有兩種:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，轉(zhuǎn)染的DNA 不必整合到宿主染色體，轉(zhuǎn)染的基因會(huì)隨著細(xì)胞的增殖逐漸丟失;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是將轉(zhuǎn)染的目的基因整合到染色體DNA 中，從而建立克隆的細(xì)胞系［15］。研究基因化細(xì)胞移植對(duì)癲癇的療效則需要GAD65 基因在MSCs 中長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒載體是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的理想載體。慢病毒載體來(lái)源于人類(lèi)免疫缺陷病毒-1(HIV-1)一種基因轉(zhuǎn)移載體，因其具有可感染分裂及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易引起免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)被廣為應(yīng)用［16～18］。因此，將長(zhǎng)為1758 bp 的GAD65 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入MSCs，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系選用慢病毒作為載體是非常合適的。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的慢病毒載體是以國(guó)際通用的第3 代載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過(guò)改建構(gòu)成的四質(zhì)粒系統(tǒng)，慢病毒載體刪除了全部HIV-1 的編碼基因，應(yīng)用安全穩(wěn)定。用包裝產(chǎn)生的高滴度的病毒液感染MSCs，感染效率高，感染率大于90%，通過(guò)嘌呤霉素篩選擴(kuò)大培養(yǎng)后得到穩(wěn)定表達(dá)GAD65基因的細(xì)胞株。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了GAD65 慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，證實(shí)慢病毒載體構(gòu)建成功。包裝產(chǎn)生的病毒液濃度為5×107TU/ml。將病毒液感染大鼠MSCs。Western blot 檢測(cè)顯示蛋白表達(dá)顯著升高。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建GAD65 慢病毒表達(dá)載體，并可以在MSCs 中正確過(guò)表達(dá)，為進(jìn)一步研究基因化細(xì)胞治療癲癇奠定基礎(chǔ)。

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