布美他尼可通過下調NKCC1 和AQP4 表達減輕缺血性腦水腫及神經損傷

王橋生，蔡 鳴，符 暉，阮中繁，高祚芝，湯石林，蘇 華，羅 瓊，武 衡

缺血性腦水腫是缺血性腦卒中、心臟驟停等原因所致常見的并發癥，嚴重者可發展為惡性腦水腫、顱內高壓，危及患者生命，其發生發展的病理生理非常復雜。電中性共同轉運體(Na+-K+-2Cl-共同轉運體-1，NKCC1)在中樞神經系統有大量表達，在腦水腫發展過程中起重要作用［1，2］。腦梗死［3，4］、顱腦創傷［5］、肝性腦部［6］等疾病可激活和上調NKCC1的表達，加重腦水腫。而其特異性抑制劑布美他尼(一種髓袢利尿劑)除了常規利尿脫水作用，還存在特異性抑制NKCC1、調節其表達等機制拮抗腦水腫，但具體的機制不是很明確。而另有研究證實水分子的轉運通道水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)在維持腦組織水平衡中扮演重要角色，多種病因均可AQP4 上調，加重腦水腫。那么布美他尼在特異性抑制NKCC1 的同時，是否會通過調節AQP4 表達協同發揮抗腦水腫的作用呢?以及對神經功能有何影響?為明確上述問題，我們通過制做SD 大鼠右側中動脈腦缺血再灌注模型，靜脈注射布美他尼干預后，觀察患側腦組織腦含水量變化、NKCC1 和AQP4 表達變化，同時通過觀察大鼠神經行為學評分、腦梗死灶周圍細胞凋亡情況，明確布美他尼減輕腦水腫的機制及對神經功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 SPF 級雄性SD 大鼠，鼠齡3～4 個月，體質量250～300 g，購于南華大學動物部。按隨機數字法隨機分為以下3 組:(1)假手術組;(2)腦缺血組;(3)布美他尼組。每組60 只。布美他尼組于造模前15 min 經尾靜脈注入15 mg/kg［7］的布美他尼［廣西梧州制藥(集團)有限公司，0.5 mg/2 ml］;假手術組和腦缺血組不予藥物干預。

1.2 大鼠大腦中動脈局灶腦缺血再灌注模型的建立及神經行為學評分 按照Cheng J 等［8］描述的方法，線栓法制做大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注模型。假手術組不放置線栓。術后24 h 對大鼠進行神經行為學評分，檢測各組大鼠神經功能情況。即待動物麻醉清醒后，以Longa 五級四分法為標準進行評分［9］:0 分:無神經缺損癥;1 分:提尾時癱側前肢內收，不能全伸直;2 分:向癱側旋轉;3 分:行走時向癱側傾倒;4 分:不能行走或昏迷。

1.3 患側大腦半球腦含水量測定 于再灌注0 h、3 h、6 h、12 h 和24 h，各時間點取5 只大鼠，深麻醉后，斷頭法處死動物，迅速取腦。干濕比重法評估患者大腦半球含水量，即用稱量缺血側大腦半球濕重后置100 ℃烤箱中，72 h 后稱缺血側大腦半球干重，按公式:BWC=(1-干重/濕重)×100%，計算出缺血側大腦半球BWC。

1.4 免疫組化檢測腦梗死灶周圍NKCC1 和AQP4 表達 于再灌注6 h、12 h 和24 h，各組取10只大鼠分別行石蠟切片免疫組化觀察NKCC1 和AQP4 的表達情況。具體方法如下:予4%中性甲醛灌注固定后，取腦組織常規脫水、石蠟包埋，從視交叉后5 mm 行冠狀位切片5 張，片厚5 μm。SABC法行免疫組化:即常規脫蠟和水化，3%H2O2孵育消除內源性過氧化物酶活性，微波高溫加熱行抗原修復后，山羊封閉液封閉。然后分別滴加濃度為1∶100 的NKCC1 一抗(Santa Cruz Biotechnology，Inc;sc-21545)或AQP4 一抗(Santa Cruz Biotechnology，Inc;sc-9888)孵育過夜，0.01 mmol/L PBS 沖洗后，滴加生物素化二抗孵育30 min，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液孵育30 min，DAB 染色，最后蘇木素復染細胞核，脫水封片。先光鏡顯微鏡觀察各組梗死灶周圍NKCC1 或AQP4 表達情況，陽性細胞目的抗原反應區域呈棕黃色，相應細胞核呈紫藍色。Imagepro plus 圖像分析軟件測量陽性區域灰度值，每個組織檢測5 個區域，取平均值，并重復5 只大鼠行統計分析。系統設定白色最大灰度為256，黑色最小灰度為0。灰度值越小，代表陽性反映程度越高。

1.5 TUNEL 法檢測腦梗死灶周圍細胞凋亡于再灌注24 h，各組取5 只大鼠斷頭法取腦，迅速取視交叉后5 mm 冠狀位新鮮腦組織放入液氮中冷卻，-20 ℃平衡溫度后，OCT 固定包埋，從視交叉往后行冠狀切片，片厚5 μm，置入無水甲醇固定30 s，共取片6 張。切片室溫晾干后，用0.01 mmol/L PBS 沖洗5 min×3;0.3%過氧化氫甲醇溶液封閉30 min 以清除內源性過氧化物酶;PBS 沖洗5 min×3;0.5%曲拉通X-100 浸泡15 min;PBS 沖洗5 min×3;取FITC 標記的TUNEL 反應混合液50 μl(上海碧云天生物技術有限公司，C1086)室溫避光孵育1 h;PBS 沖洗5 min×3;然后予濃度為0.1 μg/ml DAPI 染色;PBS 沖洗5 min×3;進行防熒光衰竭封片劑進行封片;免疫熒光顯微鏡200 倍下觀察梗死灶周圍細胞凋亡情況，隨機取6 個視野，凋亡率(%)=每個高倍視野凋亡細胞數/每個高倍視野總的細胞數×100%。計算各組缺血灶周圍神經元凋亡率。

1.6 統計學分析 采用IBM SPSS 20.0 統計軟件包對數據進行處理。正態分布計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用One-Way ANOVA 方差分析;非正態分布計量資料予中位數(最小值、最大值)表示，采用Kruskal-Wallis 法多組秩和比較;以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠患側腦含水量 同假手術組相比，在再灌注3 h、6 h、12 h 和24 h，腦缺血組大鼠患側BWC 顯著增高(P＜0.05);而予布美他尼干預后，在再灌注6 h、12 h 和24 h，患側BWC 明顯降低(P＜0.05)(見圖1)。

2.2 各組大鼠腦梗死灶周圍NKCC1 表達情況在再灌注6 h、12 h 和24 h，假手術組NKCC1 表達無明顯變化(見圖2A、B、C);在腦缺血組，腦梗死灶周圍細胞膜上可見大量的棕黃色顆粒，隨再灌注時間進行性增加(見圖2D、E、F);而予布美他尼干預后，各觀察時間點，NKCC1 表達減低(見圖2G、H、I)?；叶戎禉z測顯示(檢測的灰度值與表達呈負相關)，腦缺血組灰度值均低于相應時間點假手術組(P＜0.05)，而布美他尼組灰度值均高于相應時間點腦缺血組，提示予布美他尼干預后，NKCC1 表達下降(見表1)。

2.3 各組大鼠腦梗死灶周圍AQP4 表達情況在再灌注6 h、12 h 和24 h，假手術組AQP4 表達無明顯變化(見圖3A、B、C);而在腦缺血組，腦梗死灶周圍細胞膜上可見大量的棕黃色顆粒，隨再灌注時間進行性增加(見圖3D、E、F)。予布美他尼干預后，各觀察時間點AQP4 表達減低(見圖3G、H、I)。灰度檢測結果顯示(檢測的灰度值與表達呈負相關)，各觀察時間點，腦缺血組灰度值均低于相應時間點假手術組(P＜0.05)，而布美他尼組灰度值均高于相應時間點腦缺血組，提示予布美他尼干預后，AQP4 表達下降(見表2)。

2.4 各組大鼠神經行為學評分 假手術組各大鼠評分均為0 分，提示無神經功能損害。根據各組平均秩次，平均秩次越高，神經功能損害越嚴重，布美他尼組平均秩次低于腦缺血組(32.45 vs 48.55)，提示神經功能損害減輕(見表3)。

2.5 各組大鼠再灌注24 h 腦梗死灶周圍細胞凋亡情況 在再灌注24 h，TUNEL 檢測各組大鼠腦梗死灶周圍細胞凋亡情況，結果顯示同假手術組相比，腦缺血組細胞凋亡顯著增加(P＜0.05)，而予布美他尼干預后，細胞凋亡明顯減少(P＜0.05)(見圖4)。

表1 各組大鼠腦梗死灶周圍NKCC1 灰度值(±s，n=5)

表1 各組大鼠腦梗死灶周圍NKCC1 灰度值(±s，n=5)

與假手術組相比* P＜0.05;與腦缺血組相比#P＜0.05

表2 各組大鼠腦梗死灶周圍AQP4 灰度值(±s，n=5)

表2 各組大鼠腦梗死灶周圍AQP4 灰度值(±s，n=5)

與假手術組相比* P＜0.05;與腦缺血組相比#P＜0.05

表3 再灌注24 h 各組大鼠神經行為學評分

圖1 各組大鼠缺血側腦含水量變化

圖2 免疫組化檢測各組大鼠梗死灶周圍NKCC1 表達變化(×200 倍)

圖3 各組大鼠腦梗死灶周圍AQP4 表達情況(×200 倍)

圖4 各組再灌注24 h 腦梗死灶周圍細胞凋亡率

3 討論

本研究結果顯示，大鼠大腦中動脈局灶腦缺血再灌注后，隨著腦梗死灶周圍NKCC1 和AQP4 表達明顯上調，缺血側大腦半球腦含水量增加。而予布美他尼干預后，兩者表達下調，缺血側腦含水量下降。大量研究證實離子通道和水通道的激活和表達變化在細胞性腦水腫的發展過程中扮演重要角色。其中電中性離子轉運通道NKCC1 在維持細胞電中性、細胞正常體積和腦組織液體平衡起重要作用。多種病因所致腦損傷后，NKCC1 表達上調，Na+、Cl-經其流入細胞內，細胞內外滲透壓增高，導致腦水腫加劇。本研究發現，在大鼠大腦中動脈缺血2 h，再灌注6 h、12 h 和24 h NKCC1 表達均顯著增高，梗死側腦含水量進行性增加，而布美他尼干預后，NKCC1表達下調，梗死側腦含水量下降。提示布美他尼可通過抑制并下調NKCC1 表達減輕缺血所致腦水腫。Yan Y 等［10］研究發現，在大鼠局灶腦缺血2 h 后，再灌注4 h、8 h、12 h 和24 h 皮質NKCC1 表達明顯上調，腦水腫明顯加重，而在缺血前大腦皮質注射布美他尼后腦含水量降低幅度達70%。類似的發現也被其他研究證實［6，9，11，12］。

NKCC1 增加腦水腫的機制探索中，首先是因為其在腦組織有廣泛表達，包括神經元細胞、星形膠質細胞、脈絡叢上皮細胞和血管內皮細胞，腦缺血缺氧后，活性氧、細胞外高鉀以及炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)等因素均可上調NKCC1 的表達，促進Na+、Cl-和K+向細胞內轉移，導致細胞性水腫發生［1，11］。有研究發現，在腦血管內皮細胞管腔膜側表達NKCC1，在缺血缺氧下，NKCC1 的激活及上調，Na+等進入血管內皮細胞，并通過基底膜側的Na+/K+ATP 泵及Na+/H+泵將Na+轉移至腦實質，導致腦水腫加重［13］。亦有研究發現，上調脈絡叢上皮細胞NKCC1 表達明顯增加腦水腫［7］。其次，NKCC1的活性依賴于其磷酸化水平，多個研究證實，腦梗死［4，11］、顱腦創傷［7，14］、氨中毒［6，15］均可上調磷酸化NKCC1 表達。而布美他尼可通過抑制和下調NKCC1 的表達，并可能通過阻斷上述機制，減少Na+從血液向腦實質轉移及向細胞內轉移，從而減輕腦水腫。另外，本研究結果顯示，在再灌注6 h、12 h和24 h，腦梗死周圍AQP4 表達明顯上調，而使用布美他尼干預后，AQP4 表達亦明顯下降，腦水腫減輕。研究證實低氧誘導因子-1 α、谷氨酸、多巴胺、血管加壓素、低滲狀態等因素均有明顯上調AQP4 表達。布美他尼有減少谷氨酸釋放，減少細胞壞死和抑制神經元凋亡作用［3，12，16］。本研究中，布美他尼下調AQP4 表達，其原因可能與布美他尼減少谷氨酸釋放、改善腦損傷等因素有關，但其具體的機制有待進一步探索。同時，在本研究中，我們發現，布美他尼干預后，同缺血組相比，神經行為學評分改善，腦梗死灶周圍細胞凋亡顯著減少;提示布美他尼有減輕缺血性腦損傷神經功能損傷。與文獻報道的一致［3，5，7，12］。

本研究初步探索了布美他尼治療腦水腫的其他非利尿機制和對神經功能的影響，其相應具體的機制還待深入探索?？傊?，從本研究，我們初步得出結論，布美他尼可通過下調NKCC1 及AQP4 表達，減輕缺血性腦水腫，并改善神經功能。

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