TopoⅡ、Ki—67、P53在胃食管結合部腺癌新輔助化療療效預測中的意義

張志忠等

[摘要] 目的 探討Topo Ⅱ、Ki-67和P53 在Siewert Ⅱ型胃食管結合部腺癌中的表達與化療敏感性之間的關系。方法 回顧性分析本院2010年6月～2013年12月行新輔助化療的胃食管結合部腺癌患者72例。對所有患者均行SOX方案化療，以RECIST 1.0評價標準評價療效。用免疫組化方法評價3種蛋白的表達情況，分析各蛋白表達情況及與化療療效的關系。 結果 年齡和病理類型與化療敏感性無關，本組72例患者中新輔助化療有效率為48.6%，其中5例達病理完全緩解。3種蛋白的表達情況分別為：Topo Ⅱ陽性率為73.6%， Ki-67陽性率為59.7%， P53陽性率為33.3%。 Ki-67和P53的表達與化療敏感性有關（P=0.023，P=0.031），但Topo Ⅱ的表達與化療敏感性無關（P>0.05）。 結論 Ki-67高表達和P53低表達是AGEJ SOX方案新輔助化療敏感性的影響因素，為AGEJ個體化新輔助化療方案的選擇提供有益的參考。

[關鍵詞] 胃食管結合部腫瘤；新輔助化療；Topo Ⅱ； Ki-67；P53；化療敏感性

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）04-0113-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of Topo Ⅱ， Ki-67， P53 in advanced adenocarcinoma of gastroesophageal junction（AGEJ） and its relationship to sensitivity of neoadjuvant chemotherapy. Methods Clinical data of 72 patients of locally advanced AGEJ between June 2010 and Dec 2013 were analyzed retrospectively. All patients were given SOX neoadjuvant chemotherapy and the responses to treatment were evaluated according to RECIST 1.0. Expressions of 3 proteins were detected by in all patients before neoadjuvant chemotherapy. Detecting the expressions of Topo Ⅱ， Ki-67， P53 by immunohistochemistry is to analyze its relationship to neoadjuvant chemotherapy. Results The chemotherapy sensitivity had no correlation with age and pathological types（P>0.05）. The overall response rates was 48.6%， including complete response in 5 cases and progressive disease in 6 cases.The positive expression rates of Topo Ⅱ， Ki-67 and P53 in AGEJ were 73.6%，59.7% and 33.3%. Ki-67 and P53 were significantly correlated with chemotherapy sensitivity（P=0.003，P=0.020）， while Topo Ⅱ was not correlated with chemotherapy sensitivity（P>0.05）. Conclusion An elevated expression of Ki-67 and depressed expression of P53 are important factors for SOX insensitivity in AGEJ. They may provide an useful reference for designing individualized chemotherapeutic regimens for AGEJ patients.

[Key words] Gastroesophageal junction neoplasms； Neoadjuvant chemotherapy；Topo Ⅱ； Ki-67；P53；Chemosensitivity

近年來胃食管結合部腺癌（adenocarcinoma of gastroesophageal junction，AGEJ）的發病呈增長趨勢[1，2]。現已證實新輔助化療對進展期胃癌能提高手術切除率、減少術后復發轉移、延長生存期[3]。但對于Siewert Ⅱ型胃食管結合部腺癌新輔助化療的療效針對性研究較少。尋找可靠的化療敏感性預測指標、早期篩選出對化療應答不敏感的患者、減少不必要的術前化療，已成為重要臨床課題之一。結合既往胃癌方面的研究成果，我們回顧性檢測3種蛋白質：Topo Ⅱ、Ki-67和P53在AGEJ癌活檢標本中的表達，研究化療藥物敏感性的差異，尋找可靠的化療敏感性預測指標、期望篩選出可能對SOX方案新輔助化療敏感的預測因子，為AGEJ癌的個體化治療提供重要的依據。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2010年6月～2013年12月在河南省安陽市腫瘤醫院行新輔助化療的72例進展期Siewert Ⅱ型AGEJ癌患者。其中男63例，女9例；年齡40～76歲（中位年齡67歲）；治療前臨床分期均為cT3～4Nl～3。術前病理類型：中、低分化腺癌66例（其中4例伴印戒細胞癌，7例伴黏液腺癌），高分化腺癌2例，黏液腺癌3例，印戒細胞癌1例。研究對象的選擇標準：①胃鏡活檢病理確診為腺癌；②排除遠處轉移；③腹部增強CT顯示局部腫塊侵犯胃壁全層（T3或T4）或有區域淋巴結腫大；④所有患者體力狀況（ECOG）評分為0～2分，且無嚴重心、肺、肝、腎等臟器功能異常者；⑤無其他惡性腫瘤病史及放化療史者；⑥簽署知情同意書，愿意接受術前化療及手術者。

1.2治療方案

所有患者行SOX方案新輔助化療：奧沙利鉑注射液130 mg/m2靜脈滴注2～3 h d1+替吉奧膠囊40～60 mg bid po d1～14。3周后重復，共2次。化療同時予以地塞米松、西米替丁、格拉司瓊、苯海拉明等輔助用藥治療?；熃Y束后4周進行術前療效評價，若無腫瘤進展則行標準胃食管結合部腺癌根治術（D2）。術后給予常規輔助化療。

1.3 檢測方法

1.3.1 臨床檢測 新輔助化療前對活檢腫瘤組織作3種蛋白檢測，在新輔助化療前后分別進行胃鏡（或超聲胃鏡）、64排增強CT檢查以對比療效評價，手術者術后行病理組織學檢查、療效評價。

1.3.2 免疫組化檢測 標本的處理及免疫組織化學染色：所有標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續切片厚4 μm。玻片用多聚-L-賴氨酸涂覆，常規蘇木素-伊紅（HE）染色，確定病理類型。采用檸檬酸緩沖液微波抗原修復法。實驗試劑：鼠抗人Topo Ⅱ（Ki-S1）、鼠抗人Ki-67（MAB-0129）、鼠抗人P53（DO-7）、即用型單克隆抗體、檢測試劑盒（KIT-9701）、陽性對照片均購自福州邁新生物技術開發公司，操作按說明書進行。

S-P免疫組織化學染色方法簡述如下：石蠟切片經常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復；滴加過氧化酶阻斷液室溫10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS） pH=7.2沖洗后滴非免疫性動物血清室溫10 min，滴加第1抗體即抗Topo Ⅱ、抗Ki-67、抗p53，4℃冰箱孵育過夜；PBS沖洗后滴加生物素標記的第2抗體室溫10 min；PBS沖洗后滴加鏈霉素親和素-過氧化物酶溶液室溫10 min，PBS沖洗后二氨基聯苯胺（DAB）顯色，沖冼，蘇木素復染，封片，顯微鏡觀察。每次實驗用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。Topo Ⅱ、Ki-67、P53蛋白均定位于細胞核，以細胞結構中存在粗細一致的棕黃色顆粒為陽性。陽性細胞數<50%表示基因低表達，計為（-），而≥50%則表示基因高表達，計為（+）。以上結果由2名病理學專家閱片判斷。

1.4 療效判斷

以新輔助化療前后胃鏡（或超聲胃鏡）、64排增強CT及術后病理切片作為療效判斷的證據。新輔助化療后原發病灶的療效判定根據RECIST 1.0[4]標準評估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）、疾病進展（PD）。以CR+PR計算有效率（RR）。毒性反應采用NCI-CTC 3.0不良反應分級標準判定[5]。

1.5 統計學分析

使用SASW18.0統計軟件，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，相關分析采用Logistic多因素回歸分析及Spearman秩相關處理相關數據。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1 病理特征

分化良好型[6]（包括管狀腺癌、乳頭狀腺癌、高中分化腺癌）38例，分化不良型（低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌、未分化癌和單純癌）34例。PD患者共6例未行手術治療，余66例均行R0切除，年齡<65歲者45例，≥65歲者27例?；颊吣挲g、腫瘤分化程度與化療效果關系見表1。

2.2 治療情況

本組72例患者全部完成新輔助化療SOX三周方案兩個周期。不良反應主要為惡心、嘔吐、粒細胞減少、血小板減少、外周神經毒性，經對癥治療后緩解，未出現Ⅲ度及以上毒副反應。新輔助化療后4周行標準胃食管結合部腺癌根治術（D2），術中進行腫瘤測量。術后并發癥：3例患者出現吻合口出血，2例患者出現吻合口瘺，均保守治療后治愈。

2.3 新輔助化療結果及術后病理結果

本組66例手術患者新輔助化療綜合療效判斷：5例CR（6.9%），30例PR（41.7%），31例SD（43.1%）。新輔助化療總有效率RR（CR+PR）為48.6%，顯示對SOX三周方案化療敏感。術后病理結果：5例未見殘留癌細胞，均為低-中分化腺癌或低分化腺癌，而且不合并黏液腺癌或印戒細胞癌等其他成分。4例僅見灶狀散在癌細胞簇，分別為中低分化腺癌、中分化腺癌合并乳頭狀腺癌、低分化腺癌、中分化腺癌。顯示單純中低分化腺癌化療效果較好。術后病理分期（2010年美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer， AJCC）第7版TNM分期標準）[7]：術后病理9例無法分期（5例未發現殘留癌細胞，4例癌細胞零散分布，無法判定T分期），Ⅱ期23例、Ⅲ期34例。

2.4 各個蛋白檢測的結果

各蛋白的表達與年齡、分化程度無明顯相關性（P>0.05）。在72例AGEJ癌標本中，3種蛋白的表達情況及與化療療效的關系見表2。Topo Ⅱ陽性表達為53例（73.6%），在CR+PR組和SD+PD組之間無顯著性差異（P>0.05）；Ki-67陽性表達43例（59.7%），在CR+PR組中陽性率明顯高于SD+PD組（χ2=8.593，P=0.003）；P53陽性表達24例（33.3%），在CR+PR組中陽性率明顯低于SD+PD組（χ2=5.449，P=0.020）。多元回歸結果顯示Ki-67是影響胃食管結合部腺癌新輔助化療療效的獨立因子（P=0.015）。Spearman相關分析顯示：Topo Ⅱ的表達與Ki-67的表達呈正相關（r=0.405，P=0.001），而TopoⅡ與P53、Ki-67與P53的表達之間均無明顯相關性（P>0.05）。

3討論

研究表明[8]AGEJ與中遠段胃癌在臨床病理指標及分子標記物上存在顯著差異，提示AGEJ與中遠段胃癌的發生發展過程中可能存在不同的分子機制。新輔助化療在胃癌中受到越來越多的重視，Li等[9]報道新輔助化療能顯著改善中國人局部進展期胃癌的治療效果。但將AGEJ單獨進行新輔助化療研究的報道仍較少。腫瘤細胞耐藥是降低消化道腫瘤患者生存率的主要原因。如何預測AGEJ化療敏感性的問題有待解決。如果能找到較為準確的預測新輔助化療敏感性標志物.將有助于臨床醫生根據腫瘤的分子生物學特征選擇更有效的治療方案，減少原發性耐藥的比例，避免不獲益的治療。

本研究中應用SOX方案對AGEJ進行新輔助化療，有效率為48.6%，與胃癌的報道基本相似[10]，達到了降期、提高R0切除率的目的。本組72例患者新輔助化療不良反應主要為惡心、嘔吐、粒細胞減少、血小板減少、外周神經毒性，經相應治療后緩解，不良反應均在可控制范圍內；術后并發癥僅有3例吻合口出血、2例吻合口瘺，提示新輔助化療是安全的，并未增加手術并發癥及手術風險?；熜Чc年齡、分化程度無明顯相關性。

本文回顧性研究了Topo Ⅱ、Ki-67和P53在胃食管結合部腺癌新輔助化療前的表達，探討其與化療敏感性的關系。腫瘤細胞中Topo Ⅱ表達的增強可以提高以DNA拓撲異構酶為靶點的抗腫瘤藥物的抗癌效果[11]。其含量下降及酶活性的改變引起易解離復合物形成減少，導致DNA損傷減少而致藥物耐受。在本研究中Topo Ⅱ的表達與化療效果之間無明顯相關，與在部分胃癌輔助化療中研究[12，13]相一致，其表達尚不能預測SOX方案在胃食管結合部腺癌新輔助化療的作用。Ki-67是一種細胞核抗原，僅在增殖細胞核中表達，與細胞的合成代謝有關， 其表達水平能較全面客觀地反映腫瘤細胞的增殖狀態，是較為理想的檢測細胞增殖活性的抗體。研究已證實[14，15]，Ki-67是判斷腫瘤患者化療療效的重要指標。本研究的結果顯示：Ki-67的表達與化療敏感性有關，Ki-67高表達患者對化療敏感，療效優于低表達患者，并且多因素回歸分析顯示，Ki-67是獨立的化療敏感性影響因素。突變型P53基因是促癌基因，當該基因發生突變時，對細胞凋亡的調控作用受阻，導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐受性。本組結果顯示，P53表達陽性者新輔助化療有效率明顯低于表達陰性者，與胃癌[13，16]的研究結果相似。Ki-67的表達與Topo Ⅱ的表達呈正相關（r=0.405，P=0.001），而Ki-67與P53表達無明顯相關性（r=-0.090，P=0.49）。

總之，本研究應用免疫組化檢測了3種蛋白在AGEJ中的表達，發現Ki-67和P53與化療敏感性有關，可作為評估化療預后的因子。

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（收稿日期：2014-12-08）