丁苯酞預處理對大鼠缺血/再灌注腎損傷保護作用的實驗研究

薛建峰,段魯勤※，孫海棚

(泰安市中心醫院 a.老年病二科,b.泌尿內科，山東 泰安 271000)

丁苯酞預處理對大鼠缺血/再灌注腎損傷保護作用的實驗研究

薛建峰a,段魯勤a※，孫海棚b

(泰安市中心醫院 a.老年病二科,b.泌尿內科，山東 泰安 271000)

摘要：目的探討丁苯酞對SD大鼠腎臟缺血/再灌注損傷的保護作用。方法將60只SD大鼠采用隨機排列表分組法分為對照組、預處理組(單純丁苯酞灌胃)、假手術組、預處理手術組(丁苯酞灌胃并雙腎腎動脈夾閉手術)、手術組(單行雙腎腎動脈夾閉手術)，每組12只。預處理組和及預處理手術組造模前給予丁苯酞80 mg/(kg·d)灌胃2周，制備SD大鼠腎臟缺血/再灌注急性腎損傷(AKI)模型。檢測各組大鼠在缺血/再灌注24 h時血肌酐、尿素氮變化情況，蘇木精-伊紅染色觀察腎臟病理。結果假手術組、預處理手術組和手術組尿素氮水平分別為(8.9±1.6)、(33.2±7.7)、(44.9±17.3) mmol/L，顯著高于對照組的(6.1±1.2) mmol/L,差異有統計學意義(P<0.05)，但預處理手術組尿素氮低于手術組(P<0.05)；預處理手術組和手術組血肌酐水平分別為(246±50) μmol/L、(318±81) μmol/L，顯著高于對照組的(43±5) μmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)，但預處理手術組低于手術組(P<0.05)。預處理手術組和手術組病理損傷評分分別為(2.4±0.7)分、(3.0±0.6)分，其余3組數為0分，但預處理手術組腎臟損傷程度低于手術組(P<0.05)。結論丁苯酞預處理對缺血/再灌注性AKI大鼠模型腎功能具有一定的保護作用。

關鍵詞：缺血/再灌注損傷；急性腎損傷；丁苯酞

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是多種病因引起的腎小球濾過率急劇下降，導致代謝產物無法排出，進而在血液中聚集的一種綜合征，是臨床常見危重癥。其中缺血/再灌注損傷是AKI的主要病因之一。缺血/再灌注性AKI是臨床中各種外科手術，特別是心臟體外循環術常見的術后并發癥[1-3]。丁苯酞又稱芹菜甲素，是一種具有線粒體保護功能的微循環重構劑，研究證實丁苯酞對心、腦等組織的缺血/再灌注損傷具有很好的預防作用[4]。本研究旨在從動物模型的角度探討丁苯酞對腎臟缺血/再灌注性AKI的保護作用。現報道如下。

1材料與方法

1.1動物60只健康SD雄性大鼠，8周齡，體質量180~250 g，分籠飼養，標準大鼠飼料喂養。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK(京)2012-0001，無特定病原體級。采用隨機排列表法分為5組：對照組、預處理組(單純丁苯酞灌胃)、假手術組、預處理手術組(丁苯酞灌胃并雙腎腎動脈夾閉手術)、手術組(單行雙腎腎動脈夾閉手術)，每組12只。

1.2試劑與儀器丁苯酞(恩必普，石藥集團恩必普藥業有限公司)、水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)、血肌酐、尿素氮生化試劑盒(瑞士Roche)、石蠟包埋機(德國Leica EG1150H)、石蠟切片機(德國LEICA-RM-2245)；顯微鏡(日本Nikon eclipase 55i)、Imagepro-Plus軟件病理圖文分析系統。

1.3實驗方法預處理組及預處理手術組于術前2周開始按80 mg/(kg·d)丁苯酞灌胃；非手術組、對照組和假手術組于術前2周開始給予等體積生理鹽水灌胃。

1.3.1缺血/再灌注腎損傷模型制備10%水合氯醛300 mg/kg行腹腔麻醉。將麻醉后大鼠仰臥位固定于37 ℃恒溫床上，備皮；劍突下約1橫指腹部正中偏縱行切開皮膚，切口長約4 cm，腹白線切開筋膜層及肌層，使用右手食指入左側腹腔翻出大鼠左側腎臟，棉簽分離腎蒂周圍脂肪組織，暴露腎動脈，使用無創動脈夾夾閉腎動脈，待腎臟顏色變淡及腎臟包膜皺縮后表示夾閉成功，同樣方法夾閉右腎，兩側腎臟夾閉時間間隔約為1 min。夾閉成功后將雙腎暫時還納入腹腔，溫生理鹽水紗布覆蓋切口，將大鼠放入37 ℃恒溫毯中。腎動脈血流阻斷45 min后，松開動脈夾，可見紫黑色腎臟首先出現花斑樣變色，后變為粉紅色，表示模型制造成功。雙腎復位，腹腔注射2 mL溫生理鹽水后關腹。將大鼠放入37 ℃保溫毯中待其蘇醒。假手術組為麻醉后開腹翻出腎臟，不進行雙腎動脈夾閉。

1.3.2制備石蠟切片雙腎血流恢復后24 h，將大鼠麻醉，取其血清及腎臟組織。將腎組織切成1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小的組織塊，4%甲醛溶液固定48 h；后使用75%乙醇15 min×2次、95%乙醇20 min×3次、無水乙醇50 min、無水乙醇60 min浸泡脫水。后多次浸泡于75%乙醇及無水乙醇脫水。脫水后的標本浸泡于二甲苯溶液中20 min×2次透明。透明后的組織依置于3杯石蠟中浸泡20 min、30 min和60 min后包埋成蠟塊，將蠟塊切成2 μm厚的切片，在38 ℃水浴箱中展片并鋪于玻片上標記，將玻片在55 ℃烤片機上烤片1 h，置于烘箱中烘烤過夜。

1.3.3蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)將切片脫蠟后依次使用無水乙醇、95%乙醇及蒸餾水洗片，使用蘇木精染色10 min，蒸餾水洗片至組織呈灰色，使用1%鹽酸乙醇分化數秒后再次洗片，用伊紅染色10 min，再經無水乙醇及二甲苯洗片后使用中性樹膠封片。

1.3.4腎功能損傷評定光鏡下(200×)在每個標本的外髓外帶隨機選取至少40個不重疊視野。以腎小管擴張、上皮細胞脫落，或腎小管基膜裸露為腎小管損傷標志，根據受損腎小管占觀察單位的比例進行評分，0分：無腎小管損傷；1分：損傷腎小管比例<20%；2分：損傷腎小管比例21%~50%；3分：損傷腎小管比例50%~75%；4分：損傷腎小管比例>75%[5]。

2結果

2.1各組SD大鼠尿素氮、血肌酐比較假手術組、預處理手術組、手術組尿素氮水平較對照組顯著升高(P<0.05)，但預處理手術組尿素氮低于手術組(P<0.05)；預處理手術組和手術組血肌酐水平較對照組顯著升高(P<0.05)，但預處理手術組低于手術組(P<0.05)。見表1。

表1　各組SD大鼠尿素氮、血肌酐比較　±s)

a與對照組比較，P<0.05；b與預處理手術組比較，P<0.05

2.2大鼠腎臟組織病理學變化對照組大鼠腎臟HE染色(圖1A)腎小球無明顯病變，毛細血管袢開放良好，內皮細胞、系膜細胞和上皮細胞無增生或壞死；而預處理手術組和手術組的腎臟肉眼及可見明顯的皮髓質交界處充血缺血帶，HE染色，鏡下可見病變主要位于外髓外帶近端小管，近端小管上皮細胞刷狀緣廣泛脫落，細胞腫脹、空泡變性，腎小管基膜裸露、管腔內有大量脫落的上皮細胞碎片，部分可見遠端小管內上皮細胞管型(圖1B、圖1C)。5組實驗動物腎臟損傷最為嚴重的是手術組,病理損傷評分為(3.0±0.6)分，其次為預處理手術組為(2.4±0.7)分，其余3組腎臟無明顯病理學變化,病理損傷評分均為0分。預處理手術組較手術組降低了近20%(F=2.24,P=0.035)。

圖1　SD大鼠腎臟組織病理學變化(HE染色 ×200)　A：對照組；B：預處理手術組；C：手術組

3討論

目前AKI早期診斷已取得部分進展，但在AKI的早期預防方面尚需進一步研究，本研究以丁苯酞為研究對象，使用最為常用有效的缺血/再灌注性AKI大鼠模型，探討丁苯酞對AKI的預防保護作用。這種模型血肌酐會在再灌注后24 h內達到高峰，因此本研究選擇這個時間點采集模型鼠的血清和腎臟組織進行對比研究，結果顯示，預處理手術組的模型鼠腎功能下降程度低于手術組，腎臟損傷評分也降低，表明預防性使用丁苯酞能對AKI模型鼠的腎臟發揮一定的預防作用。實驗中假手術組大鼠血清尿素氮水平出現輕度上升，血肌酐升高明顯，分析可能的原因為假手術組大鼠雖未行動脈夾閉，但在手術過程中，腹腔內臟的暴露及血液的流失導致大鼠體循環血量的降低，而大鼠在手術結束后又有一段時間麻醉蘇醒過程，不能及時補充體循環血量，致使腎功能出現輕度下降。

腎臟的再灌注損傷是心臟體外循環術心臟復跳后常見的并發癥，臨床表現為血肌酐的升高，病理表現為線粒體的腫脹、變形、崩解。血肌酐輕度升高會增加患者病死率并延長住院時間，其中25%的患者需要行連續性腎臟替代治療。因此，早發現、早預防成為AKI治療的關鍵。作為一種快速級聯反應，缺血/再灌注損傷廣泛存在于心、腦、肝、腎、胃腸道等器官[6]，可能的機制包括白細胞、自由基的作用、鈣超載、興奮性氨基酸毒性等。發病過程涉及多個凋亡相關基因[7]，凋亡方式主要涉及非caspase依賴路徑及caspase依賴路徑[8]。丁苯酞是我國科學家從芹菜籽中提取的有效成分，商品名稱為恩必普，作為治療急性腦梗死的有效藥物，被寫進《2010年中國急性缺血性腦卒中診治指南》。經研究，丁苯酞通過重構腦血循環，增加缺血區灌注，保護線粒體，減少神經細胞凋亡來治療急性腦卒中，其機制是丁苯酞能對凋亡途徑中關鍵的caspase-3蛋白發揮抑制作用，進而阻斷多個缺血/再灌注性病理環節，改善缺血區微循環，保護線粒體能量泵，并阻止氧糖剝奪后導致的線粒體損害及細胞凋亡作用，進而達到保護腦細胞的目的[9]。

本研究受到丁苯酞治療腦梗死取得良好效果的啟發，在大鼠缺血/再灌注性腎臟損傷模型的基礎上，應用丁苯酞對其進行干預，結果顯示，預防應用丁苯酞對缺血/再灌注性腎臟損傷具有一定保護作用。其可能的機制包括提高缺血區血流量；抗氧化減少細胞凋亡；改善線粒體腫脹和空泡化。雖然本研究的思路是創新性的，但未能對丁苯酞預防AKI機制進行更深入的研究，且未進行動態學觀察，希望在以后的研究中進一步完善。

參考文獻

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Experimental Study of the Protective Effect of Butylphthalide Preconditioning on Ischemia Reperfusion Renal Injury in Rat

XUEJian-fenga，DUANLu-qina，SUNHai-pengb.

(a.theSecondSectionofDepartmentofGeriatricMedicine，b.DepartmentofUrology,Tai′anCentralHospital，Shandong,Tai′an271000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of the preventive application of butylphthalide on ischemia reperfusion renal injury in SD rats.MethodsA total of 60 SD rats were randomly divided into control group,pretreatment group(simple butylphthalide gavage),sham operation group,pretreatment operation group(butylphthalide gavage and double renal artery clipping operation),operation group (single pair of renal artery clipping operation) by random arrangement table，with 12 rats in each group.Rats in pretreatment group and pretreatment operation group were given butylphthalide 80 mg/(kg·d) to gavage for 2 weeks before modelling,to prepare SD rat model of renal ischemia reperfusion acute renal injury.Changes of blood creatinine,uremic nitrogen at 24 h of ischemia reperfusion of all the groups were detected,and renal pathological results were observed by hematoxylineosin staining.ResultsUrea nitrogen levels of the sham operation group,pretreatment operation group and operation group were (8.9±1.6) mmol/L,(33.2±7.7) mmol/L,(44.9±17.3) mmol/L，significantly higher than (6.1±1.2) mmol/L of the control group,the differences were statistically significant(P<0.01)，but the urea nitrogen level of pretreatment operation group was lower than operation group(P<0.01).Blood creatinine level of the pretreatment operation group and operation group were (246±50) μmol/L，(318±81) μmol/L, significantly higher than (43±5) μmol/L of the control group, the differences were statistically significant(P<0.01),but the blood creatinine level of pretreatment operation group was lower than operation group(P<0.01).Pathological injury scores of the pretreatment operation group and operation group were (2.4±0.7) scores，(3.0±0.6) scores,significantly higher than 0 score of the control group,the differences were statistically significant(P<0.01),but pathological injury score of pretreatment operation group was lower than operation group(P<0.01).ConclusionThe preventive application of butylphthalide has a protective effect on renal function of ischemia reperfusion acute kidney injury in SD rat model.

Key words:Ischemia-reperfusion injury; Acute kidney injury; Butylphthalide

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-03-06編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.045

中圖分類號：R969.4

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)10-1852-03