抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌內生細菌KLXD06粗蛋白的提取

摘要：雪膽具有多種藥用價值，菌株KLXD06是從雪膽中分離篩選的1株對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）具有抗菌活性的內生細菌。采用硫酸銨鹽沉淀法提取KLXD06產生的抑菌粗蛋白，結果表明，用硫酸銨鹽沉淀法能提取KLXD06發酵液的抑菌粗蛋白，抑菌粗蛋白對MRSA的抗性較強，并具有一定的熱穩定性。

關鍵詞：雪膽；內生細菌；耐甲氧西林金色葡萄球菌；抑菌粗蛋白；提??；抗菌性；熱穩定性

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0334-02

收稿日期：2014-03-28

基金項目：樂山師范學院科研項目（編號：Z1160）。

作者簡介：唐梅（1971—），女，重慶人，碩士，副教授，主要從事微生物分子生物學研究。E-mail：764301686@qq.com。

通信作者：龔明福，博士，教授，主要從事微生物資源及微生物與植物間相互關系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是醫院內感染率極高的多重耐藥性病原菌[1-2]，僅對萬古霉素敏感[3]，醫源性MRSA感染性疾病與乙型肝炎（HBV）、艾滋?。ˋIDS）并列為世界范圍內三大最難解決的感染性疾病[4]。我國對藥用植物抗金黃色葡萄球菌等感染進行過一系列研究[5]，但是針對MRSA的研究較少，近幾年MRSA才得到關注[6]。

雪膽（Hemsleya sinesis Cogn.） 為葫蘆科雪膽屬植物，不但對多種病原菌具有抗菌作用[7]，還有多種藥理功效[8-10]，因而應用廣泛[11]。生活在雪膽組織中的內生細菌能產生與雪膽相似的活性成分。筆者課題組從雪膽中分離篩選到多株具有抗MRSA活性的內生細菌菌株[12]，其中菌株KLXD06抗MRSA活性極強。本研究采用硫酸銨沉淀法提取KLXD06發酵液中的粗蛋白，并檢測其對MRSA的抑菌活性，旨在為進一步開展雪膽內生細菌抗菌活性物質成分和功能研究以及抗MRSA新藥研制奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試菌株

KLXD06為筆者課題組分離保存的具有抗MRSA活性的雪膽內生細菌，經常規鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。MRSA由峨眉山特色生物資源重點實驗室提供。

1.2KLXD06抑菌蛋白提取及抑菌活性測定

1.2.1KLXD06抑菌蛋白的提取將活化的KLXD06按接種量7%接入無菌發酵培養基中，該培養基為牛肉膏蛋白胨酵母培養基（BPY）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、葡萄糖5 g、蒸餾水1 L，調節pH值7.0～7.2。37 ℃、140 r/min振蕩培養3～4 d，4 000 r/min離心15 min后棄沉淀，上清液經細菌過濾器（Φ=0.22 μm）過濾，將濾液緩慢地加入飽和硫酸銨溶液至飽和度達到60%左右放置過夜，12 000 r/min 離心10 min，棄上清液。用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為6.8）溶解沉淀，溶解液置-20 ℃保存備用。

1.2.2抑菌粗蛋白對MRSA的活性測定在直徑為9 cm的NA平板中涂布接種0.1 mL活化好的MRSA病原細菌菌懸液，在平板上等距離打4個直徑為6 mm的孔洞，用已滅菌的100 μL移液槍向其中加入濃度分別為20%、60%、100%的粗蛋白溶解液100 μL。每個處理加入等量無菌水作為對照，37 ℃ 黑暗培養1～3 d。每個處理重復3次。用“十”字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.3抑菌粗蛋白熱穩定性測定取拮抗效果明顯的1組粗提蛋白溶解液，分別在40、60、80、100 ℃水浴處理15 min和121 ℃加熱處理30 min后，按上述方法測定其對病原菌MRSA的抑菌圈直徑。以未經熱處理的原液代替處理液為對照，每個處理重復3次。用粗蛋白的剩余抑菌活性表示抑菌粗蛋白的熱穩定性。

剩余抑菌活性=（處理液產生的抑菌圈直徑/未處理原液產生的抑菌圈直徑）×100%。

2結果與分析

2.1KLXD06抑菌粗蛋白對MRSA的抗菌活性

對經硫酸銨鹽析沉淀法得到的抑菌粗蛋白溶解液進行抑菌性試驗。由表1可見，KLXD06抑菌粗蛋白對MRSA的抑菌活性明顯，100% KLXD06粗蛋白提取液對MRSA的拮抗效果較為明顯，在0.05水平上與20%、60%KLXD06粗蛋白的抑菌效果有顯著差異。該處理下平均抑菌圈直徑達到 13.7 mm，具有作為抗MRSA藥物開發的潛力。

2.2KLXD06抑菌粗蛋白的熱穩定性

由圖1可見，KLXD06菌株產生的抑菌粗蛋白在40、60、80、100 ℃水浴處理15 min和121 ℃加熱處理30 min后，仍保持一定的抑菌活性。40、60 ℃處理15 min后，剩余抑菌活性與對照保持一致，仍然保持100%的抑菌活性；80、100 ℃處理15 min后，剩余抑菌活性分別降為75.0%、63.0%；121 ℃處理30 min后，剩余抑菌活性仍保留35.5%。表明KLXD06抑菌粗蛋白具有一定的熱穩定性，可耐受121 ℃及以下的溫度。

3結論與討論

測定不同濃度雪膽內生細菌KLXD06抑菌粗蛋白對致病微生物MRSA的抑菌活性，結果表明KLXD06能分泌產生具有較高抗菌活性的產物。目前我國主要從黃岑、黃連等中草藥及其提取物中篩選抗MRSA的物質[13-15]，但中草藥成分復雜，其抑菌機制較難分析。劉佳等從土壤細菌中篩選到1株對MRSA有較好抑菌活性的芽孢桿菌[16]；黃惠琴等從海洋微生物中篩選到1株抗MRSA的海洋放線菌[17]；張守村等從苦豆子內生細菌中篩選到1株抗MRSA活性較強的菌株，并提取到1種抗MRSA的活性成分[18]。從其他藥用植物內生細菌中篩選抗MRSA菌株的研究還鮮見報道，對內生細菌抗MRSA成分的分析更少。endprint

KLXD06產生的抗菌物質可以通過硫酸銨鹽析沉淀法分離得到，并對熱穩定，本研究初步認定其抗菌活性物質的主要成分為蛋白類物質，但究竟是什么物質，結構及性質如何，是否存在其他抑菌物質，抑菌物質產生條件等問題還有待深入探討。

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