流式細胞術在網織紅細胞檢測中的應用

張嬌珍,王小敏，潘秀芳

(1.海南海口市中醫醫院檢驗科,570216；2.海南省第三人民醫院檢驗科)

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·論著·

流式細胞術在網織紅細胞檢測中的應用

張嬌珍1,王小敏1，潘秀芳2

(1.海南?？谑兄嗅t醫院檢驗科,570216；2.海南省第三人民醫院檢驗科)

[摘要]目的評價流式細胞儀測定外周血中網織紅細胞的性能。方法選取門診體檢及住院患者共300例，隨機選擇血標本，采用FACSCalibur型流式細胞儀進行網織紅細胞計數，分析其重復性，并與傳統煌焦油藍染色顯微鏡法進行對比及做相關分析。結果流式細胞儀法與傳統煌焦油藍顯微鏡法關于網織紅細胞低值、中值及高值計數分別比較，均差異無統計學意義(P>0.05)；流式細胞儀的變異系數4.3%，傳統煌焦油藍顯微鏡法8.2%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05),兩種方法測定結果呈正相關關系(r=0.994,P<0.01)。結論流式細胞儀計數網織紅細胞快速，結果準確，且重復性好，與傳統煌焦油藍染色顯微鏡法高度符合。

[關鍵詞]流式細胞術;網狀細胞;顯微鏡檢查

網織紅細胞(Ret)是介于晚幼紅細胞與成熟紅細胞之間尚未完全成熟的紅細胞，是紅細胞成熟過程的一個重要階段，是反映骨髓造血功能的重要指標[1]。檢測網織紅細胞的相關參數對臨床上眾多疾病的診斷、治療和監測有著重要的價值[2]。傳統的檢測方法為人工顯微鏡目測計數法，該方法操作費工、費時，受主觀因素影響較大，重復性差[3]。近年來，隨著熒光技術和流式細胞技術的發展及自動網織紅細胞分析技術的革新，網織紅細胞的測定自動化得到很大的發展。2014年3月至2014年7月我們采用BD公司FACSCalibur型流式細胞儀進行網織紅細胞計數，并與傳統煌焦油藍染色顯微鏡法進行對比及相關分析，為今后臨床相關疾病的診斷和治療以及預后監測提供有效的、準確的及快捷的檢測手段。

1資料與方法

1.1標本來源選取我院2014年3月至2014年7月門診體檢及住院患者共300例，其中健康體檢者100例，單純性血小板減少50例(<50×109/L)，缺鐵性貧血50例，溶血性貧血50例，急性失血性性貧血60例，其他類貧血50例，采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管取靜脈血2 mL混勻，儲存，試驗時隨機選取上述標本用于可比性分析。

1.2儀器與試劑日本OlympusBX-60型多功能光學顯微鏡，1%煌焦油藍試劑，按《全國臨床檢驗操作規程》第3版的要求配制[4],Miller窺盤，Beckman-Coulter XLMCL流式細胞儀為美國Beckman-Coulter產品及原裝配套試劑。

1.3方法

1.3.1傳統煌焦油藍顯微鏡法按《全國臨床檢驗操作規程》[4]，用煌焦油藍染液對紅細胞進行活體染色，每份標本由兩名熟練的、有經驗的檢驗技師在油鏡下計數l 000個紅細胞，獲得網織紅細胞計數結果，取平均值。

1.3.2流式細胞儀檢測法將標本試管順序編號，制備陰性對照管。對照管中加入含0.1%NaN3的PBS緩沖液1 mL和5 μL全血。試驗管中加入Retic-COUNT試劑1 mL和5 μL全血，充分混勻。室溫暗處溫育30 min，4 h內上機分析，分析前充分混勻上樣管。上流式細胞儀以Cellquest軟件獲取50 000個紅細胞，以低角度、高角度散射光對數點圖設紅細胞門，對照管調節電壓獲取陰性Marker，記錄并分析網織紅細胞平均熒光強度。試驗人員經過廠家培訓，嚴格按儀器操作規程做網織紅細胞分析，按照儀器操作規程，用配套校準品作儀器校正，當日用配套的全血質控物(低、中、高)進行室內質控，各參數結果均在其靶值允許的范圍內。

1.3.3重復性試驗取高、中、低值3份標本，用FACSCalibur流式細胞儀平行測試30次，同時進行煌焦油藍染色，每份推30張薄片油鏡下計數1000個紅細胞，分別計算出每份標本網織紅細胞計數的均值、標準差及變異系數(CV)。

1.3.4相關性試驗隨機取100份標本，在用流式細胞儀法測定網織紅細胞的同時做傳統煌焦油藍染色顯微鏡目測計數，每份標本制作2張血片，由兩名有經驗的檢驗師分別在油鏡下計數1000個紅細胞，取均值將兩者結果進行比較。

1.4統計學處理采用SPSS18.0軟件進行分析，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，符合正態分布計數資料采用χ2檢驗。

2結果

2.1流式細胞儀測定與傳統煌焦油藍顯微鏡法測定相關性評價結果結果顯示，兩種方法測定結果呈正相關關系(r=0.994,P<0.01)，直線回歸方程為Y=0.870X-0.211。

2.2兩種方法重復性試驗結果比較流式細胞儀法與傳統煌焦油藍顯微鏡法低值、中值及高值計數比較計數分別比較，均差異無統計學意義(P>0.05)；流式細胞儀的變異系數4.3%，傳統煌焦油藍顯微鏡法8.2%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

3討論

紅細胞在骨髓中生成，需經歷祖細胞、干細胞、原始紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞、網織紅細胞，最后發育為成熟紅細胞，網織紅細胞是紅細胞成熟過程中的一個重要階段，是判斷骨髓紅系造血情況和療效觀察的重要指標[5]。在不同階段的紅細胞的發展過程中，隨著紅細胞的成熟，其顏色變化會逐漸從藍色轉變為含有更多血紅蛋白成分的粉紅色細胞，而其所含的核糖核酸(RNA)成分也會相應減少。網織紅細胞是有核紅細胞剛剛失去核的階段，仍屬未完全成熟的紅細胞，介于晚幼紅細胞和成熟紅細胞之間的過渡段細胞，其胞質中殘存的嗜堿性物質RNA等源自有核紅細胞，這種嗜堿性物質經堿性染料活體染色后，形成藍色或紫色的點粒狀或絲網狀結構沉淀物，經煌焦油藍活體染色后，在包體內可見藍色點狀或網狀結構[6]，據此特性衍生出了多種檢測網織紅細胞的方法?，F其檢測方法有傳統的顯微鏡目測法，又有儀器計數法，如網織紅細胞計數儀、血細胞分析儀及流式細胞儀等。傳統檢測網織紅細胞百分比是手工計數1000個經煌焦油藍或新亞甲藍活體染色細胞，胞質中可見核酸與堿性染料復合物，并計算其個數，存在諸多缺點，如手工染色方法由于操作環節多、人為影響因素大，其重復性和準確性均有限[7]。我們結果顯示流式細胞儀法與傳統煌焦油藍顯微鏡法低值、中值及高值計數分別比較，均差異無統計學意義(P>0.05)，兩種方法測定結果呈正相關關系(r=0.994，P<0.01)，然而流式細胞儀的變異系數4.3%，傳統煌焦油藍顯微鏡法8.2%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.01)，即流式細胞儀的變異系數明顯低于傳統煌焦油藍顯微鏡法法。

表1　流式細胞儀及傳統煌焦油藍顯微鏡法重復性試驗結果比較

流式細胞儀檢測法是一種對細胞進行自動分析的高技術、其特點是快速、準確-每秒可測數千至上萬個細胞，短時間內可以得到大量相關的信息，因此在存學科領域越來越受到人們的重視[8-9]。既往有研究證實流式細胞儀檢測法的精密度比手工法高，且可在數秒中檢測1000～1500 個/s以上的紅細胞，避免了因細胞計數不足而致結果偏差的影響，結果的準確性也有所提高[10]；我們的觀察結果與此相近。另外，流式細胞儀檢測法不但可以計數網織紅細胞，還可以測定網織紅細胞中殘留RNA的熒光強度值，對于骨髓移植、化療后造血功能恢復的監測極其靈敏，是一種極早性提示指標，可作為骨髓移植治療、化療的監測指標，尤其是對骨髓移植后的早期監測具有重要意義[11]。

流式細胞儀檢測法在一定程度上也有其自身的局限性，其最大缺點是易受白細胞、JolIy小體、瘧原蟲和血小板的干擾，特別是白血病和白細胞增多的患者，其干擾主要表現在空白對照波峰拖尾、陽性區異常波峰[12]。因此，雖然流式細胞儀檢測法雖較傳統法有較大的改進，但仍不能偏廢傳統血片的檢查。傳統煌焦油藍顯微鏡法目前仍然是國內外網織紅細胞計數的經典方法，其操作簡便，試劑成本低廉，鏡下細胞形態直觀，因而仍然被廣泛應用。我們要做的是在臨床工作中，做到兩者有機的結合，充分利用兩種方法的優點，更好地為臨床服務。

參考文獻

[1]王小欽,林果為.重新認識網織紅細胞參數的臨床價值[J].中華血液學雜志,2014,35(1):1-3.

[2]吳小梅,張秋萍.SysmeXXE-5000全自動血細胞分析儀計數網織紅細胞與手工法結果的比對分析[J].國際檢驗醫學雜志,2012,33(16):2013-2015.

[3]褚靜英,羽曉瑜,陸玉霞,等.網織紅細胞鏡檢法與全自動法比較分析[J].檢驗醫學,2010,25(11):841-843.

[4]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].3版.南京東南大學出版社,2006:130-131.

[5]祝丙華,張金樹,李安全.網織紅細胞檢測進展及其臨床應用[J].國際檢驗醫學雜志,2010,31(2):191-193.

[6]董磊,吉品健,馬紅雨,等.網織紅細胞的研究進展及應用[J].醫學綜述,2012,18(6):2567-2569.

[7]陸艷,郭利利.兩種儀器檢測網織紅細胞的結果比較[J].山西醫藥雜志,2012,41(8):857-858.

[8]王桂芝，秦文華.急性白血病流式細胞術免疫分型的特點及臨床意義[J].中國臨床保健雜志,2012,15(2):141-143.

[9]李慶,陳多炎,翟志敏.流式細胞術用于念珠菌快速藥敏試驗的研究[J].中國臨床保健雜志,2007,10(2):127-130.

[10] 劉小林,周彥,孫林.流式細胞儀檢測網織紅細胞百分比性能評價[J].蚌埠醫學院學報,2010,35(8):828-830.

[11] 郭學松,王潮,蔡妹.網織紅細胞成熟指數在惡性腫瘤化療前后動態變化的臨床意義[J].現代醫藥衛生,2011,27(10):1497-1498.

[12] 熊見,解小紅,王長本,等.流式細胞術檢測網織紅細胞的多參數分析及方法評價[J].檢驗醫學與臨床,2010,7(13):1295-1296,1298.

Application of flow cytometry for reticulocyte detection

ZHANGJiaozhen*,WANGXiaomin，PANXiufang

(*LaboratoryMedicineDepartment,HaikouTCMHospital,Haikou570216,China)

[Abstract]Objectives To evaluate the flow cytometric in reticulocyte detection of peripheral blood.MethodsA total of 300 cases of outpatient and hospitalizd patients were selected in our hospital from March 2014 to July 2014.Reticulocyte of random blood samples were detected by FACSCalibur flow cytometry.The repetition of FACSCalibur flow cytometry was analyzed and the correlation analyzed between FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy.ResultsThere were all no significant differences about the reticulocyte counting of low,median and high value between FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy respectively.The coefficient of variation of flow cytometry was 4.3% and that the traditional brilliant cresyl blue staining microscopy was 8.2%.There was significant difference between two methods (P<0.05).The correlation between the determination results of FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy was positive(r=0.994,P<0.01).ConclusionReticulocyte counting by Flow cytometric is fast,accurate,and good reproducibility.The results of reticulocyte counting by Flow cytometric are highly consistent with the traditional brilliant cresyl blue staining microscopy.

[Key words]Flow cytometry;Reticulocytes;Microscopy

(收稿日期：2014-10-20)

中圖分類號：R446.113

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.015

作者簡介：張嬌珍,主管檢驗師,Email:zjz0216@163.com