丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腎組織核轉錄因子κB表達的影響

熊園園,李中南，劉珊珊，張帆，張培培

(1.安徽中醫藥大學，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科；3.安徽省省直機關醫院)

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·基礎研究·

丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腎組織核轉錄因子κB表達的影響

熊園園1,李中南2，劉珊珊2，張帆2，張培培3

(1.安徽中醫藥大學，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科；3.安徽省省直機關醫院)

[摘要]目的探討核轉錄因子κB(NF-κB)在糖尿病大鼠腎組織中的表達水平及丹蛭降糖膠囊(DJC)的調節作用。方法取55只健康雄性大鼠按數字表法隨機分為兩組，即健康對照組和實驗組。健康對照組予普通飼料喂養，實驗組予高脂飼料喂養。采用鏈尿佐菌素(STZ)單次腹腔注射35mg/kg，建立糖尿病動物模型，造模成功后，再將實驗組按數字表法隨機分為丹蛭高劑量組,丹蛭低劑量組,吡咯列酮組和模型組。除模型組和對照組外，各組連續灌胃藥物8周，丹蛭高、低劑量組分別按1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1灌胃，吡格列酮組按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康對照組和模型組按5 mL·kg-1·d-1給予0.9%氯化鈉注射溶液灌胃。免疫組織化學法檢測NF-κB在腎臟中的表達水平，并測定各組大鼠血糖。結果模型組的NF-κB的表達明顯升高，與健康對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；丹蛭高、低劑量組灌胃8周后，兩組NF-κB的高表達明顯下降，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。丹蛭降糖膠囊灌胃2周后，血糖顯著下降，與模型組比較(P<0.01)，4~8周后血糖指標下降平穩(P<0.01)。結論丹蛭降糖膠囊可降低2型糖尿病大鼠血糖和抑制腎組織NF-κB的高表達。

[關鍵詞]糖尿病腎病；NF-κB；降血糖藥(中藥);模型,動物

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見且最嚴重的慢性并發癥之一，研究表明，炎癥機制在糖尿病腎病的發生發展中發揮著重要的作用，有學者提出把糖尿病腎病看作一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病[1]。核轉錄因子κB(NF-κB)是一類重要的核轉錄因子，參與了炎癥和凋亡等病理生理過程，與此同時NF-κB信號途徑在胰島素抵抗發生機制中有著非常重要作用，NF-κB信號轉導通路的活化與炎性反應及胰島素抵抗的發生密切相關[2-5]。本次實驗旨在探討丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腎臟NF-κB表達的影響及其可能的調節機制。

1材料與方法

1.1實驗動物 取健康雄性大鼠55只，體質量(190±20)g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供，合格證：SCXK(皖)2012~2013。動物分籠喂養，自由飲食，室內通風良好，溫度保持在18～25 ℃，相對濕度為40%～70%，適應性喂養1周。

1.2藥物與試劑吡咯列酮(杭州中美華東制藥有限公司產，15 mg/片,批號:Hz0050500)；丹蛭降糖膠囊(DJC)(0.4g/粒，由太子參、地黃、牡丹皮、澤瀉、水蛭等組成，安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥制劑中心生產，批號:20060601)；鏈尿佐菌素(STZ,美國Sigma公司，批號：S0130)；通用型二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：131208K)。

1.3主要儀器與設備血糖監測儀(美國強生公司產),JD801形態分析系統(購自江蘇省捷達科技發展有限公司)。

1.4動物分組模型建立及干預55只健康雄性大鼠用基礎飼料(蛋白質16%，碳水化合物50%，脂肪8%，購自安徽醫科大學動物室)，適應性喂養1周，按數字表法隨機抽取 9只作為健康對照組，余為實驗組。健康對照組給予基礎飼料喂養直至實驗結束；實驗組予以高脂飼料喂養(蛋白質14%，脂肪25%，碳水化合物51%，膽固醇5%，豬油10%)，4周后進行造模，禁食8 h 后，將STZ用0.1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.4)配成2%濃度，按35 mg/kg的劑量給大鼠左下腹單次注射，誘發糖尿病模型，120 h后取尾靜脈測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。剔除造模未成功的大鼠5只，將造模成功后的41只的大鼠按數字表法隨機分成模型組11只，丹蛭低劑量組10 只，丹蛭高劑量組10只，吡格列酮組10 只，按人與大鼠單位體質量折算系數計算出藥物組給藥量，丹蛭高、低劑量組分別按1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1灌胃，吡格列酮組按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康對照組和模型組按5 mL·kg-1·d-1給予0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，繼續給予高脂飼料喂養8周至實驗結束，期間因血糖過高死亡2只，皮膚感染死亡2只。

1.5指標檢測與方法連續治療8周，禁食8 h，以3%水合氯醛按10 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速分離雙腎，將新鮮組織置于凍存管中放于液氮中保存，嚴格按照免疫組織化學標準步驟進行操作。并于造模后、治療后2周、4周和8周測定鼠尾隨機末梢血糖。選用JD801形態分析系統，對所選取視野中免疫組織化學陽性信號進行圖像分析，計算每個視野中NF-κB的陽性指數。免疫組織化學每張切片高倍鏡下(×400)依次觀察腎小球、腎間質區域不重疊視野，并分析NF-κB與血糖相關關系圖。

1.6統計學處理使用SPSS17.0軟件進行統計分析，兩組比較采用t檢驗，組間比較采用方差分析。

2結果

2.1各組大鼠腎組織NF-κB表達的變化光鏡觀察顯示：NF-κB在健康對照組腎組織中基本不表達或呈弱陽性表達；模型組的NF-κB在腎組織中表達明顯升高，特別在腎小管及腎間質細胞中最為明顯，呈強陽性；與模型組比較，丹蛭高、低劑量組腎組織NF-κB表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，吡格列酮組腎組織中NF-κB的表達降低，差異有統計學意義(P<0.01)。丹蛭高、低劑量組中NF-κB陽性細胞數治療后明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01)，療效優于吡格列酮組，見圖1，表1。

2.2對大鼠隨機血糖的影響造模后，模型組，丹蛭高、低劑量組，吡格列酮組血糖較正常組明顯升高(P<0.01)，治療2周后，丹蛭高、低劑量組血糖明顯降低(P<0.01)，丹蛭高劑量組療效優于吡格列酮組。治療4~8周后，血糖下降平穩，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3對NF-κB與血糖的相關性分析高血糖與NF-κB的表達呈正相關性，相關系數r=0.897,P<0.01。

3討論

結合大量古今文獻調查，在既往中醫證候學調查的基礎上，我們得出氣虛陰虧血瘀為糖尿病腎病基本病機，并以此為理論依據，參照中醫文獻中藥藥理部分研究最新成果，選擇具有益氣養陰活血功效的丹蛭降糖膠囊，觀察了對腎臟NF-κB的影響。本實驗研究發現，與正常組比較，模型組大鼠腎組織中NF-κB活性明顯升高。予丹蛭降糖膠囊灌胃8周后，腎組織中NF-κB表達明顯減弱且優于吡格列酮組，提示丹蛭降糖膠囊可抑制糖尿病大鼠腎NF-κB的過高表達，從而發揮對腎臟的保護作用。本研究結果還顯示丹蛭降糖方有很好的降糖效果(P<0.01)，其療效與吡格列酮組近似。通過對糖尿病模型大鼠NF-κB與血糖相關性分析提示：NF-κB的表達與大鼠血糖呈正相關，表明NF-κB與血糖關系密切。目前，已證實高血糖和氧化應激的主要靶點是轉錄因子NF-κB，并通過其調控與炎癥、細胞增殖、細胞分化等密切相關的多種基因的表達，更多的研究正逐步向人們揭示糖尿病與炎癥和各種炎性因子之間存在必然的聯系[6-7]。

本方由太子參、地黃、牡丹皮、澤瀉、水蛭等組成，既符合氣虛陰虧血瘀的中醫病機，又符合糖尿病腎病現代藥理研究基礎[8]。方中水蛭是一味傳統活血中藥，對炎癥的早期及后期病理改變均有抑制作用，對急慢性炎癥有一定的控制作用，具有類炎性介質拮抗作用，可高效清除循環免疫復合物，調節機

表1　各組糖尿病模型大鼠NF-κB陽性面積、平均灰度、陽性指數的比較±s)

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

表2　對大鼠不同時間段血糖的影響±s)

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01體免疫功能[9]；太子參具有益氣健脾、生津潤肺作用，能改善糖尿病大鼠的一般狀況，降低空腹血糖，降低三酰甘油和總膽固醇水平，但不影響胰島素水平[10]；牡丹皮具有清熱涼血，活血散瘀之功效，其主要活性成分為丹皮酚，蔣舜媛[11]的研究證明，牡丹皮具有解熱、抗炎、保肝、抗變態反應的作用；生地黃可清熱涼血，養陰生津，地黃苷D可明顯提高血虛模型小鼠白細胞數、血小板數、網織紅細胞數和骨髓 DNA 含量及重量，還有降低糖尿病模型小鼠血糖的趨勢[12]。生地黃水煎劑對大鼠實驗性甲醛足腫脹有顯著的消腫作用[13]。

總之，本研究結果顯示丹蛭降糖方可抑制糖尿病大鼠腎組織NF-κB表達，其機制可能是通過多途徑干擾了炎癥狀態，對抗了炎性因子，抑制了NF-κB的高表達并降低血糖。

(本文圖1見插圖1-1)

參考文獻

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The influence of danzhijiangtang capsule on the expression of NF-κB in renal tissue of diabetic rats

XIONGYuanyuan*，LIZhongnan，LIUShanshan，ZHANGFan,ZHANGPeipei

(*AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression level of NF-κ B in renal tissue of diabetic rodent model and the regulating action of Danzhijiangtang Capsule(DJC) .MethodsFifty-five male SD rats were randomly divided into 2 groups:control group and experimental group.The control group was fed with basal diet,the experimental group were fed with high fat diet.The animal model of diabetes mellitus were established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ,35mg/kg).The experimental group were randomly divided into 4 groups:high-dose DJC,low-dose DJC ,pioglitazone and model.The group of high-dose DJC and low-dose DJC were treated with 1.08 g·kg-1·d-1,0.54 g/(kgod),pioglitazone group was treated with 10 mg·kg-1·d-1,the blank group and the model group were treated with physiological saline 5 mL·kg-1·d-1,each group were kept intragastric administration for 8 weeks.The NF-κB was test by Immunohistochemical.ResultsThe expression of NF-κB in model group increased significantly compared with the normal control group (P<0.01);the expression of NF-κB in high DJC group and low DJC group were significantly decreased compared with model group after 8 weeks(P<0.01).After 2 weeks ,the level of glucose was decreased significantly compared with model group(P<0.01) ,the blood glucose declined steadily after 4-8 weeks(P<0.01).ConclusionDanzhiJiangtang Capsule can reduce the level of blood glucose in type 2 diabetic rats and inhibit the expression of NF-κB in renal tissues.

[Key words]Diabetic Nephropathies；NF-kappa B；Hypoglycemic agents(TCD);Models,animal

(收稿日期：2014-09-05)

Corresponding author:LI Zhongnan，Email:LZN5151307@sohu.com

中圖分類號：R587.24

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.017

作者簡介：熊園園，碩士在讀，Email:2052910480@qq.com通信作者：李中南，主任醫師，碩士生導師，Email：LZN5151307@sohu.com

基金項目：國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項立項課題(JDZX2012004)