P15基因抑制宮頸癌細胞遷移及侵襲的體外實驗研究

宋敬，張卓然，李越，韓世愈

(1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院,a 婦產科,b藥學部,哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫院婦產科)

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·基礎研究·

P15基因抑制宮頸癌細胞遷移及侵襲的體外實驗研究

宋敬1a，張卓然1b，李越2，韓世愈1a

(1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院,a 婦產科,b藥學部,哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫院婦產科)

[摘要]目的探討P15基因轉染對宮頸癌細胞系Hela細胞遷移和侵襲的影響。方法脂質體介導將pcDNA3.1(+)轉染Hela細胞，穩定篩選后用RT-PCR檢測轉染細胞的P15的表達。根據轉染的不同實驗分為空白組、空載體轉染組及p15 轉染組。細胞劃痕實驗檢測P15對Hela細胞遷移的影響；Transwell小室實驗檢測P15對Hela細胞侵襲的影響。 結果RT-PCR 發現空白組與空載體轉染組細胞的p15 基因 mRNA 無表達，p15 轉染組細胞p15mRNA 高表達；三組細胞0 h劃痕寬度差異無統計學意義(P>0.05)，48 h后P15轉染組的劃痕寬度明顯變窄，小于空白組及空載體轉染組(P<0.05)，空白組及空載體轉染組劃痕寬度差異無統計學意義(P>0.05)。48 h后P15轉染組的穿透細胞數明顯少于空白組及空載體轉染組(P<0.05)，空白組及空載體轉染組穿透細胞數比較差異無統計意義(P>0.05)。結論P15能夠明顯的抑制宮頸癌細胞的遷移與侵襲。

[關鍵詞]宮頸腫瘤；HeLa細胞；轉染;細胞運動

宮頸癌是慢性演變過程，多種因素及多種基因參與其中，使宮頸癌的發生及發展呈多步驟、多階段的過程[1]。宮頸癌細胞侵襲性較強，目前已知其與細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子、Bcl-2、Caspase、Smac/DIABLO等基因有關，近來研究發現，P15與宮頸癌的發生及進展關系密切。李霞[2]的研究結果顯示，P15基因與宮頸癌的浸潤、轉移及病人的生存期顯著相關。P15基因最早研究其在細胞增殖調控中發生負性作用，且在多種器官腫瘤中 P15基因呈現出不同程度的缺失、重排、突變[3-5]。本次研究通過質粒轉染P15基因，觀察其對宮頸癌細胞的遷移與侵襲性的影響。

1材料與方法

1.1研究材料真核表達質粒 pCMV5-p15(哈爾濱醫科大學藥學院重點實驗室贈)，pcDNA3.1(+)-p15(本院實驗室克隆)，Hela細胞株(上海博谷生物科技有限公司)，脂質體Lipofectamine2000(碧云天生物技術研究所)，CO2培養箱(Bekman，美國)，倒置顯微鏡及攝像器材(Nikon，日本)，Transwell小室(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養人宮頸癌Hela細胞，培養基為10%小牛血清的1640，環境控制為 37 ℃、5% CO2飽和濕度，1~2 d換液1次，顯微鏡下觀察細胞形態學特征及培養液情況，細胞鋪滿60%~70%傳代，第N+3-+4代用于繼續實驗。

1.2.2RT-PCR細胞總RNA用TRIzol試劑盒提取，引物序列見表1。反應 35 個循環，56 ℃退火。

表1　P15及actin的引物序列與長度

1.2.3基因轉染

1.2.3.1分組本實驗分為 3 組。①空白組：未轉染的Hela細胞；②空載體轉染組：用pcDNA3.1(+)-neo 質粒轉染Hela細胞；③p15 轉染組：用pcDNA3.1(+)-p15轉染Hela細胞。

1.2.3.2轉染方法參照 Lipofectamine2000轉染方法進行操作。轉染 48 h 后進行培養，3 d后篩選陽性細胞培養，達到穩定轉染后進行實驗。

1.2.4劃痕實驗在6孔板背面用marker筆以每1厘米寬度橫穿過孔劃橫線標記，每孔5條線，用直尺標記成平行線，無菌操作接種細胞，選取對數生長的細胞，直尺邊緣與標記線重疊，使用無菌槍頭比著直尺在板內沿著標記線劃痕，用PBS沖洗細胞3遍，加入1 mL無血清1640培養基，放置培養箱中孵育。分別于0 h、48 h時后取樣，倒置顯微鏡下測量劃痕寬度，并拍照。

1.2.5Transwell小室實驗制備細胞懸液，調整細胞濃度為5×105/mL。包被基底膜：Matrigel膠4℃過夜融化備用，用 4 ℃預冷的無血清1640培養基 1∶3稀釋 Matrigel 至終濃度為 1 mg/mL，冰上操作；滅菌槍頭包被小室的底部，37 ℃靜置1h，使其干成膠狀。取細胞懸液200 μL加入Transwell上室，下室加入500 μL的1640培養液，消除培養液與基質膠間的氣泡。于48 h時后取樣，吸出chamber上室液體，無菌鑷子取出chamber，移至800 μL甲醇溶液內，室溫固定 30 min。從甲醇溶液中取出 chamber，吸干甲醇溶液，移至800 μL結晶紫染色液中，室溫染色 30 min，后用去離子水輕輕沖洗，吸干液體，棉棒擦去chamber上室表面的Matrigel膠。倒置顯微鏡下隨機取 5視野，并計算穿膜細胞數。

1.3統計學處理應用SPPS 17.0統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用單因素方差分析。

2結果

2.1Hela細胞 P15 mRNA 表達檢測 RT-PCR 發現空白組與空載體轉染組細胞的P15 基因 mRNA 無表達，P15 轉染組細胞P15mRNA 高表達，見圖1。

2.2三組細胞劃痕實驗結果三組細胞0 h劃痕寬度差異無統計學意義，48 h后P15轉染組的劃痕寬度明顯變窄，小于空白組及空載體轉染組(P<0.05)，空白組及空載體轉染組劃痕寬度差異無統計學意義(P>0.05)。三組細胞劃痕實驗結果見圖2。

2.3三組細胞Transwell實驗結果48 h后P15轉染組的穿透細胞數明顯少于空白組及空載體轉染組(P<0.05)，空白組及空載體轉染組穿透細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)。三組細胞Transwell小室實驗結果見圖3。

3討論

控制腫瘤的轉移是提高宮頸癌生存率的主要方法之一[6]。腫瘤的侵襲和轉移受多種因素調節，多種基因參與其中。P15基因最早發現是細胞周期調控的關鍵因子，其主要作用是抑制細胞周期素依賴激酶 4/6(CDK4/6)活性，對細胞增殖周期進行調控。近年來發現P15基因與宮頸癌的發生及進展關系密切。Kim等[7]研究了p15在宮頸癌中的作用，表明P15基因的缺失與宮頸癌關系密切。鄭金鋒等[8]研究p15蛋白在子宮頸癌中的表達特點，結果顯示P15蛋白在宮頸癌組織的表達率為17.07%(7/41)，明顯低于在正常宮頸組織中的表達率96.67%(29/30)，P15蛋白陽性表達率與宮頸癌組織的病理學分級有關，P15與宮頸癌病理學分級存在相關性。說明抑癌基因P15的表達缺失與子宮頸癌的發生、發展和評估子宮頸癌惡性程度具有重要意義。李霞[2]的研究有著相似結果，P15基因產物的陽性表達率為55.6%(20/36)，其表達率與宮頸癌病理類型無顯著關系，但與宮頸癌的浸潤、轉移及病人的生存期顯著相關，P15基因表達產物可以作為判斷宮頸癌預后的指標。本次研究揭示了P15基因與宮頸癌細胞的遷移與侵襲的關系，結果顯示，經轉染P15的宮頸癌細胞的遷移與侵襲能力明顯降低，提示P15基因不但參與了腫瘤的生長周期的調控，更參與了腫瘤的侵潤及轉移，其有望成為宮頸癌新的治療途徑。

(本文圖1~3見插圖1-2)

參考文獻

[1]Saslow D,Solomon D,Lawson HW,et al.American cancer society,american society for colposcopy and cervical pathology,and american society for clinical pathology screening guidelines for the prevention and early detection of cervical cancer[J].CA Cancer J Clin,2012,62(3):147-172.

[2]李霞.宮頸癌組織中p15基因表達及其生物學意義[J].腫瘤防治研究,2000,27(2):99-100.

[3]Roesler JM,Livingston EH,Srivatsan E,et al.Deletion of P15(MTS2)in head and neck squamous cell carcinomas[J].J Surg Res,1998,77(1):50-54.

[4]Yurakh AO,Ramos D,Calabuig-farinas S,et al.Molecular and immunohistochemical analysis of the prognostic value of cell-cycle regulators in urothelial neoplasms of the bladder[J].Eur Urol,2006,50(3):506-515.

[5]Zhao N,Huang G,Gao L,et al.ECRG1,a novel candidate of tumor suppressor gene in the esophageal carcinoma,triggers a senescent program in NIH3 T3 cells[J].ExpBiol Med,2006,231(1):84-90.

[6]Li D,Cai J,Kuang Y,et al.Surgical-pathologic risk factors of pelvic lymph node metastasis in stage Ib1-IIb cervical cancer[J].Acta Obstet Gynecol Scand,2012,91(7):802-809.

[7]Kim JW,Namkoong SE,Ryu SW,et al.Absence of p15INK4B and p16INK4A gene alterations in primary cervical carcinoma tissues and cell lines with human papillomavirus infection[J].Gynecol Oncol,1998,70(1):75-79.

[8]鄭金鋒,馬淑芳,耿明,等.p16和p15及PCNA在子宮頸癌組織中的表達及臨床病理意義[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(4):291-293.

(收稿日期：2014-11-26)

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.018

作者簡介：宋敬，副主任醫師，Email:hydsysj@126.com

基金項目：黑龍江省青年科學基金資助(QC2013C105)