亞硝酸鹽對大鼠擠壓綜合征模型缺血／再灌注引起的肌肉損傷的影響

邢兆國，常軍英，賈東昭，王彥志，穆衛廬，李琦軍

（河北省石家莊市第三醫院創傷一科，河北 石家莊050011）

擠壓綜合征（crush syndrome，CS）是一種嚴重的疾病，特點是循環性休克和腎衰竭，常發生在地震、山體滑坡和車輛事故等災難性事件中［1］。四肢肌肉在長時間擠壓（缺血）再解除擠壓（再灌注）后即可發生CS，導致肌肉細胞破裂，即橫紋肌溶解［2］。目前，CS的推薦治療方案是生理鹽水及時補液，碳酸氫鹽和甘露醇糾正高鉀血癥，嚴重急性腎損傷時進行血液透析，否則病死率升高。Nicholson等［3］報道，在缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）大鼠的心臟和肝臟細胞中，亞硝酸鹽通過缺氧依賴的信號轉導通路對細胞起保護作用。在組織缺血的動物模型，亞硝酸鹽給藥前或在再灌注期間，可以防止I／R損傷導致的心肌梗死、腦卒中和腎損傷［4］。然而，到目前為止，一直沒有實驗證據顯示亞硝酸鹽對于CS的治療效果。因此，本研究制備大鼠CS模型，觀察亞硝酸鹽治療對肌肉細胞的損傷、血流動力學和炎癥過程以及存活率的影響，旨在為臨床治療提供證據。報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 雄性SD大鼠140只，均購于河北省實驗動物中心，體質量250～300 g，其中40只隨機分為對照組、CS組、CS＋亞硝酸鈉 （NaNO2）-100 組、CS＋NaNO2-200 組、CS＋NaNO2-400組各8只。對照組不擠壓；CS組、CS＋NaNO2-100組、CS＋NaNO2-200組、CS＋NaNO2-400組均采用自制擠壓器械，壓力為3kg，連續擠壓大鼠雙下肢6h造成肢體擠壓傷后，再分別灌注生理鹽水以及不同劑量 NaNO2（100、200和400 μmol／kg）6h。另外100只用作計算生存率。

1.2 血液和組織取樣 再灌注6h后，各組大鼠取股動脈血，應用血液氣體分析儀檢測pH、HCO3-和堿剩余值。取下腔靜脈血，4℃，5 000r／min，離心10min，利用SRL測量血漿鉀、肌酸激酶（creatinekinase，CK）和 乳 酸 脫 氫 酶 （lactate dehydrogenase，LDH）水平。取腓腸肌和肺組織標本進行髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的測量。

1.3 肌肉和血漿中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量測定采用專用的高性能液相色譜系統檢測肌肉和血漿中的亞硝酸鹽濃度。此方法是基于用離子色譜法分離的亞硝酸鹽和硝酸鹽，然后由硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，在540nm處檢測。利用甲醇沉淀去除每個樣品中的蛋白質（肌肉：甲醇=1∶2質量／體積；血漿：甲醇=1∶1體積／體積，4℃）。

1.4 平均動脈壓（mean arterial blood pressure，MAP）的記錄和分析 再灌注后，各組腹腔內注射戊巴比妥鈉（50mg／kg）進行麻醉，記錄 MAP。股動脈插管與壓力換能器連接到聚乙烯導管，通過PowerLab數據采集系統，記錄血壓。

1.5 MPO活性測定 將組織樣品置于含有0.5%十六烷基三甲基溴化銨的50mmol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）中進行勻漿，然后在冰浴中超聲處理10s，反復凍融3次后再進行超聲處理后，4℃，12 000r／min，離心10min，分光光度法測定 MPO活性［5］。取0.1mL上清液，與2.9mL的50mmol／L磷酸鹽緩沖溶液（含有20mmol／L的過氧化氫和20 g／L的鹽酸鹽）混合，用分光光度計測定在460nm處的吸光度值。1單位表示在25℃每分鐘可降解1μmol過氧化物。

1.6 血漿白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平檢測 應用大鼠IL-6的內源性ELISA試劑盒（Endogen），根據說明書測定血漿中IL-6的水平［6］。

1.7 生存率分析 CS組、CS＋NaNO2-100組、CS＋NaNO2-200組、CS＋NaNO2-400組大鼠各25只，分別擠壓6h后，觀察其48h的生存率。

1.8 統計學方法 應用SPSS13.1統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肌肉亞硝酸鹽和橫紋肌溶解標志物的含量變化 與對照組相比，CS組損傷肌肉中亞硝酸鹽含量顯著下降，鉀、CK和LDH含量顯著增加（P＜0.05）。與CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組亞硝酸鹽的含量顯著升高（P＜0.05），其中CS＋NaNO2-400組升高最明顯（P＜0.05）；CS＋NaNO2-100、-200、-400組血漿中鉀、CK和LDH含量顯著降低（P＜0.05），其中LDH含量隨NaNO2濃度增加作用明顯（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肌肉亞硝酸鹽和血清橫紋肌溶解標志物含量比較Table 1 Muscle nitrite levels and plasma rhabdomyolysis markers levels in I／R-injured CS rats（n=8,±s）

表1 各組大鼠肌肉亞硝酸鹽和血清橫紋肌溶解標志物含量比較Table 1 Muscle nitrite levels and plasma rhabdomyolysis markers levels in I／R-injured CS rats（n=8,±s）

＊P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與CS組比較 △P＜0.05與CS＋NaNO2-100組比較 ☆P＜0.05與CS＋NaNO2-200組比較（q檢驗）

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2.2 各組大鼠血壓、pH值、HCO3-和堿剩余含量變化 與對照組相比，CS組中MAP顯著下降，血液中pH 值、HCO3-和堿剩余也顯著減少（P＜0.05）；與 CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組MAP顯著升高，血液中pH值、HCO3-和堿剩余顯著增多（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠MAP、pH、HCO3-和堿剩余比較Table 2 MAP，pH，HCO3-and BE in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

表2 各組大鼠MAP、pH、HCO3-和堿剩余比較Table 2 MAP，pH，HCO3-and BE in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

＊P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與CS組比較 △P＜0.05與CS＋NaNO2-100組比較 ☆P＜0.05與CS＋NaNO2-200組比較（q檢驗）

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2.3 各組大鼠炎癥相關因子的變化 與對照組相比，CS組中血漿IL-6含量顯著升高（P＜0.05）；與CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組血漿IL-6含量顯著降低，但CS＋NaNO2-100、-200、-400組之間無明顯變化（P＞0.05）。與對照組相比，CS組肌肉和肺中MPO的活性顯著升高（P＜0.05）；與CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組肌肉和肺中MPO的活性顯著降低，且CS＋NaNO2-400組作用明顯（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血漿IL-6含量、肌肉和肺中MPO活性比較Table 3 IL-6level and MPO activity in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

表3 各組大鼠血漿IL-6含量、肌肉和肺中MPO活性比較Table 3 IL-6level and MPO activity in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

＊P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與CS組比較 △P＜0.05與CS＋NaNO2-100組比較 ☆P＜0.05與CS＋NaNO2-200組比較（q檢驗）

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2.4 各組大鼠生存率比較 CS＋NaNO2-200組和CS＋NaNO2-400組的生存率高于CS組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠生存率比較Table 4 The survival rate of four groups（只數，%）

3 討 論

亞硝酸根是一氧化氮（nitric oxide，NO）氧化過程中的生理終產物。有研究表明，心肌中脫氧肌紅蛋白主要在線粒體附近釋放，產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）導致I／R損傷［7-8］。Hendgen-Cotta等［9］報道，亞硝酸鹽可以保護小鼠心臟發生心肌梗死，在肌紅蛋白基因敲除小鼠中這種保護作用消失。因此，脫氧-肌紅蛋白可能是I／R損傷肌肉細胞中亞硝酸鹽生成NO的主要貢獻者［10］。在缺血期間，因為肌肉中的亞硝酸鹽含量降低，NO氧化酶（NO synthase，NOS）活性和亞硝酸鹽消耗增加，肌肉中的基礎亞硝酸鹽基本用完，造成NO生物活性損失、再灌注血管內皮細胞和肌肉細胞的完整性損失。研究表明，亞硝酸鹽的補充增加了心肌組織中NO的儲備和生物利用度，防止I／R小鼠心臟損傷［4］。本研究結果表明，與對照組相比，CS組中亞硝酸鹽的含量顯著降低，而亞硝酸鹽處理后肌肉中亞硝酸鹽的含量顯著提高，最終降低橫紋肌溶解癥，并且提高生存率。

再灌注后ROS誘導產生的自由基是I／R損傷的可能機制之一。在I／R損傷ROS產生的來源包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷氧化酶、黃嘌呤氧化還原酶、內皮型NOS和MPO［11］，而ROS主要來源于線粒體，線粒體電子傳遞鏈復合物的氧化還原狀態快速變化，ROS形成大大提高，造成再灌注時大量的電子傳遞給氧。ROS誘導胞漿中酶發生變性，并且破壞細胞膜脂質過氧化過程。ROS介導的肌漿網功能障礙也導致大量細胞內鈣超載，導致線粒體通透性轉換孔開放，從而導致細胞壞死。亞硝酸鹽對I／R損傷的細胞保護機制是由粒線體電子傳遞鏈復合物IS-亞硝基化介導的。S-亞硝基化的復合物I降低了線粒體ROS的形成，并且亞硝酸鹽減少細胞色素C釋放，抑制細胞凋亡［3］。本研究結果顯示，亞硝酸鹽治療減少了血漿中橫紋肌溶解標志物——鉀、LDH和CK的釋放。表明亞硝酸鹽對CS受傷的肌肉細胞具有保護作用，具體的分子機制還需要進一步的研究。

本研究為了觀察亞硝酸鹽的抗炎作用，檢測了受傷及周圍組織中炎癥因子IL-6的水平。IL-6升高的幅度與組織損傷嚴重程度和不良預后相關，因此，IL-6水平可用于評定患者的治療效果［12］。IL-6水平增強反映了血管內皮細胞和循環中白細胞之間的異常相互作用，提示全身炎癥反應，如多器官功能衰竭。本研究結果表明，亞硝酸鹽處理后顯著降低了血漿中IL-6水平和肌肉、肺中MPO的活性，從而減少了遠程器官功能衰竭，并且提高了CS大鼠的生存率。

另外，要考慮的一個重要問題是亞硝酸鹽治療CS是否適用于臨床上，取決于劑量、給藥途徑以及亞硝酸鹽的不良反應——低血壓。本研究結果表明，靜脈注射200μmol／kg NaNO2后使 MAP增加，400μmol／kg NaNO2再灌注后6hMAP也維持在較高的水平，且400μmol／kg NaNO2與200 μmol／kg NaNO2處理的大鼠相比，生存率差異無統計學意義。亞硝酸鹽的給藥劑量和途徑尚需進一步研究，亞硝酸鹽治療大鼠CS模型對生存率的有利影響，可能是通過恢復和改善周邊微血管灌注和線粒體呼吸引起的。

綜上所述，在CS大鼠模型中靜脈給予亞硝酸鹽可以明顯降低I／R誘發肌肉損傷，并且可以提高生存率。

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