間歇性變應性鼻炎患者外周血調節性T細胞和白細胞介素17的變化

李保衛，石小偉，吳 瑋＊，徐冰心，丁瑞英，范日升

（1.中國人民解放軍第306醫院耳鼻咽喉頭頸外科，北京100101；2.福建醫科大學第二附屬醫院耳鼻咽喉科，

福建 泉州362000；3.中國人民解放軍第306醫院中心實驗室，北京100101；4.中國人民解放軍63710部隊衛生處，山西 忻州136200）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是發生在鼻腔黏膜的變態反應性疾病，對患者生活質量有嚴重影響。關于AR發病的免疫機制目前尚未完全明確。調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T細胞17（T help cell 17，Th17）是近年發現的新的CD4＋T細胞亞群，前者因細胞表面表達白細胞介素2受體α鏈（即 CD25），被命名為 Treg［1］。有研究發現，CD4＋CD25＋調節性T細胞可能與哮喘發病相關［2］，但其與AR的關系仍不明確。CD4＋CD25＋調節性T細胞的特異性轉錄因子是叉頭／翼狀螺旋轉錄因子3（forkhead box protein-3，Foxp3）［3］。Th17 以 產 生 的 白 細 胞 介 素 17（interleukin-17，IL-17）為其特征性因子［4］。目前研究表明，Th17細胞亞群可能在炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤中發揮重要的調節作用［5］。本研究通過觀察間歇性變應性鼻炎（intermittent allergic rhinitis，IAR）患者間歇期、發作期前（發作期前2周）、發作期及對照組外周血中Treg和IL-17的變化，探討二者在IAR發病中的作用。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3—11月我軍某部某基地資料完整的IAR患者19例，男性18例，女性1例，年齡22～48歲，平均（32.5±6.4）歲，均符合 AR診斷標準［6］；另選擇同期當地志愿者為對照組共27例，男性20例，女性7例，年齡22～33歲，平均（26.5±3.8）歲。對所有研究對象進行詳細的病史采集以及專科查體，并進行皮膚點刺試驗，排除哮喘和特異性皮炎等其他變態反應性疾病、鼻息肉等鼻部疾病以及全身其他疾病，且患者2周內未使用皮質激素或抗組胺藥。患者及對照組均征得本人同意，并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 試劑：變應原點刺試劑（阿羅格）；小鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、小鼠抗人CD4-APC單克隆抗體、小鼠抗人CD25-APC單克隆抗體、小鼠抗人IL-17A-PE單克隆抗體（美國BD公司）；小鼠抗人Foxp3-PE單克隆抗體、大鼠抗人IgG2α-PE、固定／破膜濃縮劑、固定／破膜稀釋液、破膜稀釋用BUFFER（E-Biosciences公司）。儀器：流式細胞儀（美國BD公司）；二氧化碳培養箱（美國Forma scientific公司）；離心機（德國KENDRO公司）；渦旋混勻器（IKA公司）。

1.3 實驗方法 分別在間歇期、發作期前及發作期3個階段于清晨空腹采取靜脈血2mL，對照組同樣條件下一次性分別各采取靜脈血2mL，肝素鈉抗凝，放置于4℃環境，4h內檢測。檢測前先配制稀釋破膜液與緩沖液，在流式管中加入100μL外周全血及CD4-FITC 10μL及CD25-APC 2.5μL，室溫避光15min后加稀釋破膜液1mL／管，混勻后4℃避光30min。離心后棄上清，每管中加入緩沖液1.5mL洗滌，分別加入2.5μL FOXP3-PE、5μL IL-17A-PE標記的抗體后4℃下避光30min。再次洗滌后予PBS稀釋，用4%多聚甲醛固定。混勻后4℃避光保存，上流式細胞儀。用BD FACSDiva軟件分析數據，結果以CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細胞、CD4＋IL-17＋T淋巴細胞在CD4＋T淋巴細胞中的百分比表示。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

IAR患者外周血中Treg和IL-17占外周血中CD4＋T淋巴細胞的比例從間歇期至發作期逐步升高。IAR患者Treg均低于對照組（P＜0.05），間歇期、發作前期、發作期間Treg雖呈增高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。IL-17在間歇期低于對照組（P＜0.05），在發作期高于對照組（P＜0.05），從間歇期、發作期前至發作期IL-17明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。Treg／Th17從間歇期至發作期下降，間歇期與對照組差異有統計學意義（P＜0.05），但發作期前、發作期與對照組差異均無統計學意義（P＞0.05），Treg／Th17發作期前、發作期與間歇期相比下降明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），發作期較發作期前亦下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 變應性鼻炎患者不同時期外周血中的Treg、IL-17比較Table 1 Changes of CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg and IL-17at different periods in peripheral blood of patients with intermittent allergic rhinitis(±s）

表1 變應性鼻炎患者不同時期外周血中的Treg、IL-17比較Table 1 Changes of CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg and IL-17at different periods in peripheral blood of patients with intermittent allergic rhinitis(±s）

＊P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與IAR間歇期比較 ☆P＜0.05與IAR發作期前比較（q檢驗）

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3 討 論

AR是指特應性個體在接觸特異性變應原后發生的主要由IgE介導的組織胺、白三烯等引起的炎性介質的釋放，并有多種免疫活性細胞和細胞因子參與的鼻黏膜炎癥性疾病。目前的研究認為Thl細胞與Th2細胞的免疫失衡促進AR的發生，向Th2細胞過度分化是導致AR的重要原因［7］。Treg細胞對二者均有抑制作用。Treg來源于CD4＋T細胞，占其比例的5%～10%，并且持續高表達IL-2受體α鏈（CD25），被稱為CD4＋CD25＋T細胞亞群，其數量的減少、表面分子表達的缺陷、抑制功能受損，均可能導致自身免疫性疾病的發生。Th17細胞作為一種新的輔助性T細胞亞群，產生的最重要的效應因子是IL-17，可與人IL-17R結合而發揮效應。目前的文獻報道多認為IL-17為前炎癥因子，可能對變應性炎癥的發病起促進作用［8-10］。當機體處于不同的狀態時，Th17細胞與調節性T細胞之間能夠相互作用，以維持機體狀態的平衡。在AR的發病中，調節性T細胞與Th17細胞的作用及其作用機制仍未完全明確。

目前Treg與AR關系的研究較多。Lee等［11］研究發現AR患者Foxp3mRNA較對照組表達下降。而 Han等［12］研究表明，與對照相比，CD4＋CD25＋調節性T細胞的表達在持續性AR患者體內無變化。另有研究發現，AR患者在經過特異性免疫治療后體內Foxp3＋調節性T細胞的數量上升［13］。由此可見，Treg在AR中的作用仍不明確。本研究結果顯示，IAR患者無論發病與否，體內CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細胞水平均較對照組有所下降。表明Treg數量不足，AR的發病可能與Treg數量下降有關。有研究發現，在空氣中花粉含量高的季節，過敏性疾病患者體內Treg的抑制活性喪失，促進過敏性疾病的急性發作和發展，而沒有花粉的季節里，不論是否患過敏性疾病，體內Treg都能發揮其免疫調節作用，從而抑制Th2細胞因子的產生［10］。而Treg的下調，可能打破Th1／Th2的平衡，表現為Th2功能增強。本研究結果顯示，在IAR的不同時期，體內CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細胞水平不同，發作期明顯升高。這表明AR患者體內的Treg存在缺陷，而且該細胞亞群的缺陷可能是特應性體質的特征，或者與機體的疾病狀態或者說過敏癥狀無關。

目前關于IL-17在AR中的表達尚存在爭議。Ciprandi等［14］首先檢測了樺樹過敏的AR患者血清中IL-17水平較對照組升高，進行舌下含服免疫治療后，癥狀最嚴重的AR患者尚能檢測到IL-17。Lu等［15］研究發現，AR患者鼻黏膜和外周血中RORγtmRNA的相對表達量及IL-17水平高于對照組，且與鼻過敏癥狀評分呈正相關。Qu等［16］研究發現，AR患者的外周血單個核細胞中的Th17比例、RORγtmRNA表達水平較對照組升高，細胞因子IL-17、IL-6及IL-23亦較對照組增加，經1年特異性免疫治療后上述檢測指標有所下降。而Klemens等［17］將AR與病毒性鼻炎對比研究中發現，只有后者鼻腔分泌物中的IL-17表達水平升高。本研究結果顯示，IAR患者分別處于間歇期、發作期前及發作期時，IL-17表達呈逐漸增高的趨勢。可能特應性個體在與外界變應原接觸后體內IL-17的釋放增加，IL-17作為前炎癥因子，與受體結合后促進相關炎癥因子釋放，對AR的發病起了促進作用，而在間歇期，缺少變應原刺激，Th17分化減弱，IL-17表達亦下調，患者的過敏癥狀則明顯緩解。

在對Treg／Th17的研究中，張成等［18］發現，與健康對照組相比較，中重度持續性AR患者，Foxp3mRNA以及血漿TGF-beta水平顯著降低，維甲酸相關孤兒受體γt及血漿IL-17水平顯著升高，這反映了AR患者體內Treg／Th17失衡的存在［19］。本研究結果顯示，在IAR患者外周血中，Treg／Th17在間歇期、發作期前、發作期呈現逐漸下降的趨勢，這也同樣反映出Treg／Th17的不平衡。但考慮到本研究樣本例數不多，IAR患者不同階段外周血中Treg／Th17是否失衡，尚待進一步研究確認。

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