強直性脊柱炎患者細胞毒性T淋巴細胞變化

孟景紅，魏 平，陳海英，王俊祥，謝建麗，張 穎

（河北醫科大學第三醫院免疫風濕科，河北 石家莊050051）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性免疫相關性炎性疾病，起病隱匿，早期難以發現，致殘率高，主要侵犯中軸關節，以骶髂關節炎為標志，但外周關節炎常為病程中的突出表現；慢性復發性和非特異性炎癥是AS的顯著特征，主要見于滑膜、關節囊、韌帶或肌腱附著點。炎癥引起附著點侵蝕，初期淋巴細胞、漿細胞及少數多核白細胞浸潤，進而肉芽組織形成，最后受累部位鈣化、新骨形成，導致關節功能受損而致殘。其發病機制至今尚未完全明確。目前研究認為輔助T細胞（T helper cells，Th）細胞亞群失衡及其相關的細胞因子分泌異常與AS發生、發展密切相關，但細胞毒性T淋巴細胞（T-lymphocytes cytotoxic，Tc）細胞亞群在 AS發病中的意義鮮有報道。本研究觀察AS患者外周血中Tc細胞亞群比例的變化，分析Tc細胞亞群比例變化特點和與疾病活動之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月—2013年10月河北醫科大學第三醫院免疫風濕科AS患者42例（病例組），符合1984年修訂的紐約標準。男性33例，女性9例；年齡18～52歲，平均（32.4±9.3）歲；病程3～40年。所有患者均為初診AS患者，既往均未應用抗風濕藥物治療。健康對照20例（對照組），男性16例，女性4例，年齡19～47歲，平均（29.5±8.4）歲。均來自健康查體者，既往無其他自身免疫性疾病，無激素類及免疫抑制劑等用藥史。2組在性別、年齡等方面差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 臨床指標 所有患者均檢測HLA-B27、白細胞計數、血小板計數、C反應蛋白（C-reactve protein，CRP）、紅 細 胞 沉 降 率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）等指標；并記錄強直性脊柱炎病情活動指數調查表（Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index，BASDAI）評分。

1.3 研究方法 抽取所有入選者外周靜脈血3 mL，以流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞表型（CD3＋CD8＋）、胞漿內細胞因子 γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）的表達。檢測步驟如下：取4個5mL試管，管號為A1、A2、A3和A4，每管中分別加入100μL新鮮肝素鈉抗凝全血。混勻后加入20μL環氧氯丙烷橡膠標記的CD3（CD3-ECD）和20μL 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標 記 的 CD8（CD8-FITC），室溫、暗環境中孵育15min。每管中加入100μL固定液，室溫、避光孵育15min。每管中加入5mL PBS，1 200r／min離心5min，棄上清。每管中加入100μL破膜和溶血液，同時A1管中加入小鼠IgG1-PE 10μL，A2管中加入IFN-γ-PE 10 μL，A3管中加入大鼠熒光標記的單克隆抗體（IgG1-PE）10μL，A4管中加入IL-4-PE 10μL。室溫，避光孵育15min。每管中加入5mL PBS，1 200 r／min離心5min，棄上清。1mL PBS重懸細胞，上機檢測。結果均以Tc中IFN-γ及IL-4表達的陽性百分率進行統計，并以同型對照抗體消除非特異性結合。

1.4 主要試劑和儀器 細胞表面標記抗體：CD3-ECD、CD8-FITC；胞漿內細胞因子抗體：IL-4-PE、IFN-γ-PE；同型對照：RatIgG1-PE（對應于IL-4-PE）、Mouse IgG1-PE（對應于IFN-γ-PE）均購美國Bekman Coulter公司；破膜劑：美國Caltag公司Fix＆Perm；應用美國Bekman Coulter公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件包進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用2個獨立樣本t檢驗；相關性采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比較 病例組具有CD3＋CD8＋受體的輔助性Tc細胞亞群和具有分泌IL-4細胞因子Tc2細胞亞群的比例均高于對照組（P＜0.01），而具有分泌TNF-γ的Tc1亞群和Tc1／Tc2的比例均低于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 2組外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比較Table 1 Tc1，Tc2and Tc1／Tc2level in peripheral blood of patients group and control group(±s，%）

表1 2組外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比較Table 1 Tc1，Tc2and Tc1／Tc2level in peripheral blood of patients group and control group(±s，%）

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2.2 相關性分析 AS患者外周血Tc、Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比值與血小板計數、ESR、CRP、BASDAI評分均無相關性，見表2。

表2 AS外周血細胞因子與白細胞計數等指標相關性分析Table 2 Correlation analysis on cytochines，white blood cell count and other indexes in peripheral blood of AS patients

3 討 論

T淋巴細胞根據其細胞表面特征性分子的不同可分為：CD3＋CD4＋T輔助性T細胞（Th）和CD3＋CD8＋細胞毒性T細胞（Tc）2個亞群。Tc細胞分為Tc1和Tc2 2個亞群，具有殺傷和調節功能，主要是通過分泌不同的細胞因子來介導；Tc1細胞以分泌IL-2及IFN-γ為特征，誘導細胞免疫反應為主；Tc2細胞以分泌腫瘤壞死因子α及IL-4等細胞因子為特征［1］。正常情況下，人體內Tc細胞的含量、功能活性以及Tc1／Tc2的比值是保持某種恒定狀態的，彼此之間相互制約、相互調控，以維持機體的免疫穩態。該平衡在多種疾病的免疫學機制中起重要作用。而在感染、藥物、精神因素等的作用下，機體內部可出現Tc淋巴細胞亞群的異常激活，導致Tc1／Tc2失衡及細胞因子的異常分泌，從而引起部分炎癥相關性疾病［1］和免疫相關性疾病。樊超等［2］研究發現，在活躍期白塞病患者體內存在嚴重的免疫功能紊亂，主要表現在Tc細胞比例上調，而且Tc細胞內合成INF-γ的能力明顯升高，導致Tc1細胞占據優勢。而在穩定期患者體內Tc細胞比例及胞內合成INF-γ的能力與正常人相比差異無統計學意義。因此，檢測Tc細胞百分比及其亞群失衡的變化可以預知機體免疫功能及疾病狀態。已有文獻報道，在類風濕關節炎［3-4］、系統性紅斑狼瘡［5-6］患者體內均存在Tc細胞數量的變化及Tc1／Tc2的失衡，雖然結果不盡一致，但均提示Tc細胞在自身免疫性疾病的發病中發揮著重要作用。而且最近有研究證明應用T細胞免疫接種療法可以治療類風濕關節炎［7］。充分證實上述觀點。

國外亦有研究發現敲除CD4基因的小鼠仍可發生脊柱關節病，而敲除CD8基因的HLA-B27轉基因大鼠的亦不能避免關節炎和結腸炎的發生［8］。提示在免疫介導的AS的發病機制中，與Th細胞一樣，Tc細胞亞群失衡及其分泌的細胞因子發揮著重要性的作用。有研究顯示，AS患者外周血中Tc細胞顯著降低，Th細胞明顯升高［9］。提示AS患者體內的確存在T細胞數量變化，但未進一步做關于Tc1／Tc2比值變化的研究。本研究結果顯示，與正常對照組相比，AS患者外周血中Tc1細胞百分數減少，而Tc及Tc2細胞百分數增多、Tc1／Tc2比值降低。與胡冰等［10-11］研究結果是一致，說明在AS患者外周血中的確存在Tc1／Tc2的失衡，而且是Tc2細胞占優勢。認為一種可能是Tc2細胞通過分泌腫瘤壞死因子α參與AS的病理反應；另一種可能為Th1細胞是關節炎癥及病理性免疫反應的主要執行者，誘導了Tc2細胞的激活及向關節局部炎癥部位的遷移，下調Th1細胞的活性，調節異常的免疫反應，從而控制疾病的進展。本研究相關分析顯示AS患者外周血中Tc、Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比值與血小板計數、ESR、CRP、BASDAI評分均無相關性，表明與疾病活動度無關。

通過對Tc1／Tc2細胞平衡在AS中作用的研究，不僅有助于闡明AS的發病機制，而且有可能為我們提供治療AS的新方法，即通過調節Tcl／Tc2細胞的動態平衡，調節過強的體液免疫或細胞免疫，從而達到治療AS的目的。

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