多西環素對哮喘大鼠血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶9的作用及血管重塑的影響

韓雪嬌，王 亮，楊紅申，侯宏偉，李亞妹，李香蘭

（1.河北省邢臺市第三醫院呼吸科，河北 邢臺054099；2.河北省胸科醫院呼吸科，河北 石家莊050041；3.河北醫科大學第二醫院呼吸科，河北 石家莊050000；4.河北省胸科醫院感染科，河北 石家莊050041；5.河北省胸科醫院護理部，河北 石家莊050041；6.河北省胸科醫院急診科，河北 石家莊050041）

支氣管哮喘是一種慢性呼吸道炎癥性疾病，主要特征是氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑。其中上皮細胞的脫落、基底膜的增厚、膠原的沉積、血管的擴張和增殖、氣道平滑肌細胞的增殖、黏液腺和杯狀細胞的增生等，稱為氣道重塑［1］。而氣道重塑是難治性哮喘的主要原因。在哮喘的血管生成和重塑中，有多種細胞及細胞因子等參與這一過程，而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）是其中2個重要因子。近來研究表明，多西環素可抑制VEGF誘導人臍靜脈內皮細胞的增殖，并可降低VEGF誘導的角膜新生血管形成的長度與面積；多西環素具有強大的抑制MMP-9作用。本研究在成功建立了大鼠哮喘模型的基礎上，采用多西環素作為干預措施，通過檢測VEGF、MMP-9的變化及肺組織內血管密度等的變化，探討多西環素抑制氣道重塑的可能機制，旨在為難治性哮喘提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠33只（雄性，6周齡，體質量50～100g，購于河北省實驗動物中心），

給予自由飲食（標準日糧和無菌飲用水，飼料購于河北省實驗動物中心）清潔級飼養，3d后進行實驗；實驗場所在河北醫科大學第二醫院動物實驗室和呼吸內科實驗室。

1.2 儀器設備和試劑 高速冷凍離心機（1-15K，美國Sigma），酶聯免疫檢測儀（MK3，芬蘭雷勃），石蠟切片機（LEICA RM2125，萊卡上海分公司），Motic 6.0數碼醫學圖像分析系統（廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司）。氫氧化鋁（美國sigma），氫氧化鋁（天津永大化學試劑開發中心），鹽酸多西環素片（江蘇瑞年前進制藥有限公司），VEGF ELISA試劑盒（上海森熊科技實業有限公司），MMP-9兔抗IgG多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司），DAB顯色劑及SP9001試劑盒（北京中山生物技術有限公司）。

1.3 實驗方法 將33只清潔級SD大鼠隨機分成對照組、哮喘組和多西環素組各11只。其中哮喘組和多西環環素組分別于實驗第1、8天向大鼠腹腔注射卵蛋白100mg和氫氧化鋁100mg（混于生理鹽水2mL中）進行致敏，第15天起將大鼠置于自制的非完全密閉霧化吸入箱內，給予卵蛋白溶液5mL霧化吸入，隔日1次，每次30min，共激發20次，根據激發效果調整給藥濃度，1～4次為1%，5～8次為1.5%，9～12次為2%，13～16次為2.5%，17～20次為3%。當大鼠出現煩躁、嗆咳、呼吸急促、活動量下降等典型的哮喘發作的表現時為激發成功。而多西環素組則在每次卵蛋白霧化吸入前30min按30mg／kg經口腔灌服方式給予多西環素［2］，對照組以生理鹽水代替卵蛋白；以上2組致敏和激發方法與哮喘組相同。在最后一次激發24h后，將大鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉，沿胸腔正中線打開胸腔，游離后暴露肺組織，結扎右主支氣管后，取右肺下葉以4%甲醛溶液浸泡固定，待行病理及免疫組織化學；左肺行肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BLAF），以1 000r／min離心10min，取其沉淀進行細胞分類和計數。

1.4 BLAF細胞計數和分類 BLAF離心后，在其細胞沉渣中加入200μL 0.9%生理鹽水，混勻后取20μL混懸液，在其中加入380μL冰醋酸；之后吸出20μL混懸液在顯微鏡下用血細胞計數板計數細胞總數。細胞沉淀甩片2張，染色（采用瑞氏-吉姆薩法染色）后行細胞分類計數，每個標本在高倍顯微鏡下計數至少400個有核細胞（除紅細胞和上皮細胞外）總數，分別計數其中的中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，從而獲得各類細胞的百分比，并由此計算出其絕對值。以上細胞計數均采用單盲法。

1.5 病理分析 ①HE染色：打開大鼠胸腔，取右肺下葉，并將所取右肺下葉浸泡于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切取5μm厚的截面標本，行常規HE染色，用中性樹膠封片，在光鏡下觀察病理改變。②免疫組織化學法檢測肺組織MMP-9及VEGF的表達：將石蠟切片脫蠟水化，反復以磷酸緩沖鹽溶液清洗，以過氧化氫室溫下孵育，再以山羊血清溫箱濕盒內孵育，再次依次給予一抗、二抗后孵育，顯色，經梯度酒精逐級脫水，最后以中性樹膠封固。陰性對照以磷酸緩沖鹽溶液替代一抗，余步驟同上。肺組織MMP-9及VEGF的表達以平均光密度值來表示。

1.6 圖像分析 于光學顯微鏡下找到完整支氣管，切片，在光學顯微鏡下（放大100倍）隨機選取完整的支氣管橫切面（中氣道，內周徑1 500～2 000 μm），使用病理圖像采集系統采集圖片。然后采用真彩色醫學圖像分析軟件進行測量分析，測量完整的無軟骨支氣管橫斷面的支氣管壁內周長（perimeter bronchial basement membrane，Pbm）、管壁面積（airway wall area，WAt）及血管密度，并計算標化測量值（WAt／Pbm）表示氣道壁厚度。

1.7 ELISA法測定血清中VEGF含量 建立標準曲線。待測品孔中每孔各加入待測樣品100μL，將反應板置于37℃120min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，每孔中加入第一抗體工作液50μL，將反應板充分混勻后置于37℃60min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次。每孔加酶標抗體工作液100μL，將反應板置于37℃60min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干每孔加入底物液100μL，置于37℃暗處反應5～10min。每孔加入50μL終止液混勻。在450nm處測吸光值。以標準品3 200、1 600、800、400、200、100、50、0ng／L之吸光值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線，將濃度作為X軸（對數軸），吸光值作為Y軸（線性軸）。曲線應為一光滑曲線，根據樣品吸光值OD值在該曲線圖上查出相應大鼠VEGF含量。

1.8 統計學方法 應用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 動物行為 哮喘組與多西環素組大鼠在激發過程中均出現呼吸急促、口唇發紺、煩躁不安等表現，實驗過程中出現毛色晦暗、反應遲鈍、精神萎靡、體質量較正常組下降等情況。而對照組大鼠在實驗過程中均未出現呼吸、精神、行為、飲食等方面的明顯變化。

2.2 各組細胞數比較 哮喘組BALF中的細胞總數、中性粒細胞數、淋巴細胞數、嗜酸性細胞數明顯高于對照組（P＜0.01）；多西環素組細胞總數、中性粒細胞數、淋巴細胞數、嗜酸性細胞數明顯少于哮喘組（P＜0.01），但仍多于對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 3組BALF中細胞總數、中性粒細胞數、淋巴細胞數及嗜酸性粒細胞比較Table 1 The numbers of total cells，neutrophils，lymphocytes and eosinophils in BALF among three groups（n=11,±s，×106／L）

表1 3組BALF中細胞總數、中性粒細胞數、淋巴細胞數及嗜酸性粒細胞比較Table 1 The numbers of total cells，neutrophils，lymphocytes and eosinophils in BALF among three groups（n=11,±s，×106／L）

＊P＜0.01與對照組比較 ＃P＜0.01與哮喘組比較（SNK-q檢驗）

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2.3 肺組織切片HE染色 對照組大鼠肺組織病理切片可見支氣管黏膜上皮、黏膜肌層、肺組織結構完整，支氣管管腔規則，偶可見炎性細胞（圖1A）。哮喘組大鼠肺組織病理切片可見支氣管黏膜增厚，氣道平滑肌明顯增厚、血管增生、血管壁增厚，支氣管黏膜下、肺泡間質可見大量炎性細胞浸潤（圖1B）。多西環素組支氣管壁增厚程度、血管增生及炎性細胞浸潤等均較哮喘組減輕（圖1C）。

2.4 各組MMP-9、VEGF的表達 哮喘組肺組織中MMP-9的表達明顯多于對照組（P＜0.01）；多西環素組較哮喘組有明顯降低（P＜0.01），但仍高于對照組（P＜0.01）。哮喘組肺組織中和血清中的VEGF表達水平均明顯高于對照組（P＜0.01）；而多西環素組則明顯低于哮喘組（P＜0.01），但仍高于對照組（P＜0.01）。見表2，圖2A～C。

2.5 各組 Wat／Pbm及血管密度比較 哮喘組WAt／Pbm和血管密度均高于對照組（P＜0.01）；多西環素組 WAt／Pbm和血管密度明顯低于哮喘組（P＜0.01），但仍高于對照組（P＜0.01）。見表3，圖3A～C。

表2 3組MMP-9、VEGF表達比較Table 2 MMP-9and VEGF expression in lung tissues among three groups（n=11，±s）

表2 3組MMP-9、VEGF表達比較Table 2 MMP-9and VEGF expression in lung tissues among three groups（n=11，±s）

＊P＜0.01與對照組比較 ＃P＜0.01與哮喘組比較（SNK-q檢驗）

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表3 3組WAt／Pbm及血管密度比較Table 3 The airway wall thickness and vasculardensity among three groups（n=11±s）

表3 3組WAt／Pbm及血管密度比較Table 3 The airway wall thickness and vasculardensity among three groups（n=11±s）

＊P＜0.01與對照組比較 ＃P＜0.01與哮喘組比較（SNK-q檢驗）

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圖1 3組肺組織的HE染色（HE×100）A.對照組；B.哮喘組；C.多西環素組Figure 1 HE staining of lung tissue among three groups（HE×100）

圖2 3組肺組織中VEGF的表達（免疫組織化學 ×100）A.對照組；B.哮喘組；C.多西環素組Figure 2 The expression level of VEGF in lung tissue of three groups（SP×100）

圖3 3組肺組織中MMP-9的表達（免疫組織化學 ×100）A.對照組；B.哮喘組；C.多西環素組Figure 3 MMP-9expression in lung tissue of three groups（SP×100）

3 討 論

3.1 哮喘患者VEGF、MMP-9表達水平的變化目前研究認為，氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑是支氣管哮喘的主要病理生理特征，其中氣道重塑則是導致難治性哮喘的主要原因。而血管重塑是氣道重塑的前提和重要組成部分。多種細胞因子、炎性介質等參與了哮喘氣道重塑過程。而VEGF和MMP-9則是其中2種參與氣道重塑、血管重塑的重要因子［3-5］。近年來世界范圍內哮喘患病率明顯升高，在不同國家或同一國家不同地區間存在差異。哮喘病呈愈來愈高發的趨勢，但控制狀況欠佳，在國內能夠完善控制哮喘的患者不足3%。因此，對哮喘控制治療藥物的研制一直都是目前研究的重點。

本實驗通過以卵蛋白致敏激發來制備大鼠哮喘模型，檢測哮喘組大鼠BALF中細胞總數及中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均明顯高于對照組，說明哮喘大鼠存在氣道高反應性及氣道炎性細胞浸潤；而在哮喘組大鼠肺組織病理中可見顯著的支氣管黏膜、氣道平滑肌增厚、腺體增生、血管壁增厚和血管增生等，符合哮喘病理學特點的病理改變，說明哮喘大鼠模型建立成功。借助圖像分析軟件測量得出其WAt／Pbm及血管密度均高于對照組，結果顯示哮喘大鼠存在氣道重塑和血管重塑。同時，應用免疫組織化學及ELISA法檢測大鼠肺組織和血清中的MMP-9和VEGF的表達水平，哮喘組大鼠肺組織中的MMP-9和VEGF的表達水平及血清中的VEGF含量較正常對照組均明顯升高，且差異有統計學意義。表明哮喘大鼠MMP-9和VEGF的表達水平升高與其氣道炎癥、氣道高反應性及血管重塑、氣道重塑的發生有關。

3.2 多西環素對VEGF、MMP-9表達水平的調節

多西環素是一種用途廣泛的抗生素［6］，是四環素的衍生物。最近研究發現，四環素可以抑制基質金屬蛋白酶的合成并廣譜抑制基質金屬蛋白酶的活性，尤其是對MMP-2和MMP-9抑制作用更為顯著［7-8］。

Lee等［2］研究了多西環素對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應性的作用，選擇以多西環素對進行干預，發現多西環素可以減少氣道內中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的數量，并降低氣道高反應性，同時降低MMP-9mRNA和蛋白的水平。

而在新生血管形成的各種因子中VEGF起著核心作用。VEGF通過與內皮細胞表面的特異性受體相結合，不僅可以促進內皮細胞增殖、增加血管通透性、促進新生血管生成，還能促進MMP的分泌。同時從哮喘的發病機制上分析，VEGF與 MMP-9尚存在潛在的關聯性。目前有研究證實，哮喘患者痰液中的VEGF和MMP-9水平明顯高于正常人，且二者存在相關性。在本實驗中通過免疫組織化學測定肺組織中MMP-9、VEGF的表達水平，同樣發現哮喘組大鼠MMP-9、VEGF的表達水平均明顯高于對照組。有學者研究發現在特發性肺間質纖維化患者BALF中MMP-9、VEGF的水平較正常人顯著升高，而經多西環素干預后以上指標的水平則可接近正常［9］。本實驗也證實經多西環素干預后，MMP-9和VEGF水平較哮喘組均明顯下降。

本實驗模型建立成功后，通過免疫組織化學及ELISA法測定MMP-9和VEGF表達水平，結果顯示哮喘組MMP-9和VEGF表達水平明顯升高，應用多西環素干預后MMP-9和VEGF表達水平較對照組稍高，但較哮喘組明顯降低，且差異有統計學意義。說明多西環素對降低MMP-9和VEGF的表達水平具有顯著作用，并由此減輕哮喘氣道重塑及血管重塑程度。這也為哮喘治療提供了新的思路。

綜上所述，氣道炎癥是哮喘的特征之一，血管重塑是氣道重塑的重要部分。MMP-9、VEGF與哮喘炎癥、氣道重塑、血管重塑密切相關［10］，二者又可相互調節。多西環素可降低MMP-9、VEGF的表達水平，具有減輕氣道炎癥氣道重塑、血管重塑的作用。關于MMP-9、VEGF對哮喘血管重塑作用機制及多西環素對其作用的深入研究也為治療哮喘開辟了新的途徑。

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