等電聚焦法檢測堿性磷酸酶同工酶在肝癌和肝癌骨轉移鑒別診斷中的應用*

龐 博，吳麗娟(.四川省彭州市中醫院檢驗科 6930；2.成都軍區總醫院實驗醫學中心，成都 60083)

?

·論 著·

等電聚焦法檢測堿性磷酸酶同工酶在肝癌和肝癌骨轉移鑒別診斷中的應用*

龐 博1，吳麗娟2△(1.四川省彭州市中醫院檢驗科 611930；2.成都軍區總醫院實驗醫學中心，成都 610083)

目的 探討堿性磷酸酶(ALP)同工酶在肝癌和肝癌骨轉移鑒別診斷中的應用。方法 用等電聚焦法(IEF)分離測定80例健康體檢者和153例肝臟疾病患者血清中的ALP同工酶。結果 采用神經氨酸苷酶處理標本后，IEF能分辨出ALP同工酶pI6.0、pI6.1、pI6.4和pI6.5共4個亞型。ALP的pI6.0和pI6.4亞型的檢出率在健康體檢組、非肝癌組、肝癌組之間差異無統計學意義(P>0.05)；pI6.5亞型的檢出率在肝癌患者組明顯高于健康體檢組和非肝癌組(P<0.01)； pI6.1檢出率在肝癌骨轉移組明顯高于肝癌無骨轉移組、健康體檢組和非肝癌組(P<0.01)。pI6.5用于肝癌診斷的靈敏度是60.7%,特異性是83.3%,陽性預測值是69.2%,陰性預測值是77.4%,符合率為74.7%。 pI6.1用于肝癌骨轉移的診斷靈敏度是70.0%,特異性是81.3%,陽性預測值是84.5%,陰性預測值是84.8%,符合率為77.6%。結論 IEF法能分離ALP同工酶不同亞型，pI6.5亞型可作為肝癌鑒別診斷指標，pI6.1亞型可作為肝癌骨轉移鑒別診斷指標。

堿性磷酸酶； 同工酶； 瓊脂糖等電聚焦電泳； 肝癌； 肝癌骨轉移

肝病是嚴重危害人類身體健康的常見病和多發病,為了進一步探討堿性磷酸酶(ALP)同工酶在不同類型肝病之間的臨床意義,幫助預測肝病的轉歸和預后,本文采用特異性較強，敏感性較高的瓊脂糖等電聚焦電泳法對健康體檢者、慢性肝炎、梗阻性黃疸、肝硬化及原發性肝癌患者血清ALP同工酶進行了分析測定，探討了ALP同工酶在肝臟疾病特別是肝癌診斷中的應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010～2012年成都軍區總醫院健康體檢者80例,其中男40例，女40例，年齡35～75歲。選擇2010～2012年成都軍區總醫院住院部肝癌患者89例，男49例，女40例，年齡35～75歲，其中發生肝癌骨轉移70例，包括男45例，女25例，年齡35～71歲。選擇2010～2012年成都軍區總醫院住院部非肝癌組64例，包括慢性肝炎32例(年齡35～75歲，男22例，女10例)、梗阻性黃疸21例(年齡35～75歲，男12例，女9例)、肝硬化11例(年齡35～75歲，男7例，女4例)。上述各組年齡分布之間差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 材料及方法

1.2.1 標本及采集 采集健康體檢者和患者的非抗凝空腹血3 mL，分離血清，進行等電聚焦電泳分析。

1.2.2 主要儀器 儀器 LK-2006多用途等電聚焦電泳儀,光密度掃描儀。

1.2.3 主要試劑及配制 兩性電解質(pH3.0～9.5)400 g/L,甘油、山梨醇、固蘭B瓊脂糖、A-萘磷酸鈉均為南京精細化工公司生產,蛋白標準品為Sigma公司生產。試劑配制方法:電極溶液陽極液為檸檬酸溶液0.2 mol/L。陰極液為乙醇胺溶液0.5 mol/L。底物液：A-萘磷酸鈉30 mg溶于10 mL 10.5%二乙醇胺,加入20 g/L硫酸鎂溶液(硫酸鎂200 mg溶于去離子水10 mL)200 μL。呈色劑：pH4.7的乙酸緩沖液10 mL溶解固蘭B 5 mg中。膠液的配制：瓊脂糖0.1 g,硫酸鋅0.008 g,加去離子水5 mL,隔水煮沸15 min后,加入50%甘油5 mL,混合,至70 ℃左右時,加入兩性電解質0.8 mL。

1.2.4 神經氨酸苷酶處理標本[1]神經氨酸苷酶(10 U/L，TypeV，來源于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌屬)溶于磷酸二氫鈉/檸檬酸緩沖液1 mL中，神經氨酸苷酶10 μL加入40 μL標本，37 ℃水浴15 min。

1.2.5 熱失活實驗 5 min 56 ℃水浴，骨ALP失活，10 min 65 ℃水浴，肝ALP失活。

1.2.6 電泳檢測[2]

1.2.6.1 等電聚焦 將準備好的膠板置于電泳槽冷卻板上,其間涂煤油,用相應的電極液潤濕陰極和陽極電極條分別放在模板標記的位置上。預電泳15 min。加樣濾紙放在離陰極端2.5 cm處后電泳,上限電壓700 V,上限電流50 mA,功率15 W,冷卻水溫度4 ℃,時間85 min。

1.2.6.2 呈色和掃描 IEF結束后,取出膠板,在膠面涂布1.5 mL底物液,40 ℃25 min,用蒸餾水洗去多余底物,加入0.5 mL呈色液,光密度計掃描,濾光片570 nm,狹縫1 mm。

1.2.6.3 測等電點 取20 μL蛋白標準品加樣,與標本同時進行電泳,IEF后將帶有蛋白標準液的膠片切割下來,進行考馬斯亮藍染色,以區帶離陰極的距離為橫坐標,蛋白標準品的等電點為縱坐標,作標準曲線,根據標本的區帶離陰極的距離,查標準曲線求得等電點(pI)。

2 結 果

2.1 等電聚焦法血清ALP同工酶亞型檢測電泳掃描圖閱讀 結果見圖1。該法分析血清ALP亞型可以在獲得的電泳掃描圖上清晰見到4個亞型，即pI為6.0、6.1、6.4和6.5對應的電泳結果掃描峰；其中pI6.0和pI6.4兩個亞型見于健康對照組和各疾病組，對與肝臟疾病包括非肝癌、肝癌和肝癌是否骨轉移均無鑒別診斷意義；pI6.5亞型主要見于肝癌患者，而pI6.1見于肝癌發生骨轉移患者。

注：A為健康體檢者；B為肝癌患者；C為肝癌骨轉移患者。

圖1 等電聚焦法檢測ALP同工酶亞型電泳掃描圖

2.2 等電聚焦法ALP同工酶亞型檢出率 結果見表1。表1結果提示，pI6.0和pI6.4的出現率在健康體檢組和非肝癌組以及肝癌組之間差異無統計學意義(P>0.05); pI6.1和pI6.5的出現率在健康體檢組和非肝癌組之間差異無統計學意義(P>0.05);pI6.1和pI6.5的出現率在肝癌組和健康體檢組以及非肝癌組之間差異有統計學意義(P<0.01); pI6.5的出現率在肝癌無骨轉移組和有骨轉移組比較差異無統計學意義(P>0.05);pI6.1的出現率在肝癌無骨轉移組和有骨轉移組之間差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 等電聚焦法ALP同工酶亞型檢測結果

注：與健康對照組比較，aP>0.05，bP<0.01；與肝癌骨轉移組比較，cP>0.05，dP<0.01。

表2 等電聚焦法分離ALP同工酶(pI6.5)用于肝癌的診斷效率

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.3 等電聚焦法ALP同工酶用于肝癌及肝癌骨轉移的診斷效率 結果見表2、3。經過統計學計算，pI6.5用于肝癌診斷的靈敏度是60.7%,特異性是83.3%,陽性預測值是69.2%,陰性預測值是77.4%,符合率為74.7%。 pI6.1用于肝癌骨轉移的診斷靈敏度是70.0%,特異性是81.3%,陽性預測值是84.5%,陰性預測值是84.8%,符合率為77.6%。

2.4 等電聚焦法ALP同工酶亞型檢出率與總ALP活性之間的關系 ALP總活性的升高不能判斷是來源于肝還是骨ALP同工酶的升高，采用IEF可分離ALP同工酶亞型，其中pI6.5的出現率在肝癌患者組明顯升高，而pI6.1的出現率在肝癌骨轉移組明顯升高，若pI6.5和pI6.1同時出現在ALP總活性升高的患者血清中，提示該患者可能存在肝癌骨轉移。

表3 等電聚焦法分離ALP同工酶(pI6.1)用于肝癌骨轉移的診斷效率

注：+表示陽性，-表示陰性。

3 討 論

ALP廣泛存在于人體各組織器官中,由4種不同的基因位點(小腸、組織非特異性、胎盤和生殖細胞)編碼小腸，很多疾病都會導致其發生變化,檢測ALP同工酶及亞型有助于臨床診斷、治療疾病和判斷預后，目前分離ALP同工酶有很多種方法,所用的支持物有聚丙烯酰胺、瓊脂糖、蔗糖和甲基化的醋酸纖維膜[3-4]。這些方法中,有的分辨率低,有的所用時間長,有的所用的支持物是劇毒的[5-10]。本研究以瓊脂糖為支持物,對制膠和電泳條件進行了改進,縮短了分離時間,提高了靈敏度和分辨率。

本試驗發現肝病患者中肝癌、慢性肝炎、梗阻性黃疸和肝硬化的總ALP活性差異無統計學意義(P>0.05)，說明總ALP的升高對判斷肝病的來源是很困難的。本試驗發現pI6.0和pI6.4的出現率在健康對眼組和非肝癌組以及肝癌組之間差異無統計學意義(P>0.05)，pI6.1和pI6.5的出現率在健康對照組和非肝癌組之間差異無統計學意義(P>0.05)，而pI6.1和pI6.5的出現率在肝癌組和健康體檢組以及非肝癌組之間差異有統計學意義(P<0.05)，pI6.1的出現率在肝癌無骨轉移組和有骨轉移組之間差異有統計學意義。在89例肝癌患者中54例有一pI為6.5的區帶,經熱失活試驗處理后，區帶消失，作者分析可能來源于原發性肝癌，因此，pI6.5的區帶對鑒別診斷肝癌有一定的臨床意義。70例肝癌骨轉移患者中49例有一pI為6.1的區帶，出現此區帶的陽性率為73.0%,這條帶的出現與總酶活性無關,將血清進行65 ℃水浴10 min后,這條區帶消失了,作者認為這條等電點為6.1 的區帶可能來源于骨ALP，對于肝癌骨轉移的鑒別診斷具有一定的臨床參考價值。本研究結果還提示，若pI6.5和pI6.1同時出現在ALP總活性升高的患者血清中，提示該患者可能存在肝癌骨轉移。

綜上所述，經改良的瓊脂糖等電聚焦電泳法可有效分離ALP同工酶，其操作簡單，價格低廉，不需要特殊的儀器設備，是一種值得推薦的實驗室診斷方法。

[1]張麗娟,吳穎,王曉鴻.腫瘤標志物聯合檢測對原發性肝癌的診斷價值[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(1):137-138.

[2]魯亮，李杭，張漢群,原發性肝癌中多項腫瘤標志物檢測的臨床意義[J].現代腫瘤醫學，2014,22(3):601-603.

[3]李萍,史茜,王波.多項生化指標在常見肝病診斷中的價值[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(23)：3205-3207.

[4]Sidney B,Rosalki A,Ying F.Incubation with neuraminidase and affinity electrophoresis with wheat germ lectin compared for separating and quantifying AKP isoenzymes in plasma[J].Clin Chem，1985,31(6):1198-1200.

[5]鄧君，王波，楊振華，等.瓊脂糖等電聚焦分離堿性磷酸酶同工酶[J].臨床檢驗雜志，1996，14(6)：283-286.

[6]章希文,高琳,張玲.降鈣素原、C反應蛋白、中性粒細胞堿性磷酸酶聯合檢測在新生兒肺炎早期的診斷價值[J].中國鄉村醫藥,2012,21(9):56-57.

[7]王蓓,閆國慶,任麗麗.北京市空港地區976例小兒骨源性堿性磷酸酶檢測結果分析[J].公共衛生與預防醫學,2014,25(2):27-32.

[8]李賢煜，趙新元，應萬濤，等.等電聚焦預分離用于肝癌細胞分泌蛋白質組的分級與鑒定[J].色譜，2013，31(9)：831-837.

[9]黃傳鐘，林科燦，王斌，等.肝癌切除肝缺血再灌注損傷前后的蛋白質組學變化[J].中國組織工程研究，2012，16(40):7539-7543.

[10]鄧君，饒紹琴，蔣黎，等.電聚焦法分離堿性磷酸酶同工酶在腫瘤診斷中的應用[J].四川省衛生管理干部學院學報，2001，20(2):84-85.

醫學統計工作的基本內容

按工作性質及其先后順序，可將醫學統計工作分為實驗設計、收集資料、整理資料、分析資料。實驗設計是開展某項醫學研究工作的關鍵，包括醫學專業設計和統計學設計，醫學專業設計的內容包括研究對象納入和排除標準、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測)指標、統計方法等。收集資料的方法包括各種試驗、檢測或調查，要求資料完整、準確、及時、有足夠數量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對、對資料進行分組與匯總等。分析資料即對資料進行統計學分析，包括進行統計描述和統計推斷。

Application of isoelectricfocusing method for detecting alkaline phosphatase isoenzymes in differential diagnosis of liver cancer and bone metastasis of liver cancer*

PANGBo1,WULi-juan2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,PengzhouMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Pengzhou,Sichuan611930,China;2.ExperimentalMedicineCenter,GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu,Sichuan610083,China)

Objective To investigate the application of alkaline phosphatase(ALP) isoenzymes detected by the agarose isoelectricfocusing(IEF) method in the differential diagnosis of liver cancer and bone metastasis of liver cancer.Methods The serum ALP isoenzyme level was detected in 80 people with healthy examination and 153 cases of liver diseases by the agarose IEF method.Results After treating the specimen by neuraminidase,ALP isoenzymes subtypes of pI6.0,pI6.1,pI6.4 and pI6.5 could be identified by the agarose IEF.The detection rates of pI6.0 and pI6.4 had no statistical differences among the healthy group,non-liver cancer group and liver cancer group(P>0.05); the detection rate of pI6.5 in the liver cancer group was significantly higher than that in the healthy control group and the non-liver cancer group(P<0.01); the detection rate of pI6.1 in the liver cancer bone metastases group was significantly higher that in the liver cancer non-bone metastases group,the healthy group and the non-liver cancer group(P<0.01).The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value and coincidence rate of pI6.5 for diagnosing liver cancer were 60.7%,83.3%,69.2%,77.4% and 74.7% respectively; which of pI6.1 for the diagnosis of liver cancer bone metastases were 70.0%,81.3%,84.5%,84.8% and 77.6% respectively.Conclusion The subtypes of ALP isoenzymes can be separated by the improved agarose IEF method.The subtype pI6.5 can be used as a differential diagnosis indicator of liver cancer and the subtype pI6.1 can be used as a differential diagnosis indicator of liver cancer bone metastases.

ALP; isoenzyme; agarose isoelectricfocusing; liver cancer; bone metastases of liver cancer

國家高技術研究發展計劃(863項目)資助項目(2014AA022304)。

龐博，男，副主任技師，碩士，主要從事生化檢驗及分子生物學檢驗方面研究。

△通訊作者，E-mail：wulijuan1638@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.001

A

1672-9455(2015)01-0001-03

2014-05-05

2014-09-22)