納米金信號放大的SPR適配體生物傳感器快速檢測血小板源性生長因子的研究*

匡 紅，曾 琳，劉書蓉，袁 璐，李金鳳，秦 濤，賈淑芳，周琳瑤(解放軍第四五二醫(yī)院檢驗科， 成都 610021)

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·論 著·

納米金信號放大的SPR適配體生物傳感器快速檢測血小板源性生長因子的研究*

匡 紅，曾 琳，劉書蓉，袁 璐，李金鳳，秦 濤，賈淑芳，周琳瑤△(解放軍第四五二醫(yī)院檢驗科， 成都 610021)

目的 構(gòu)建一種基于核酸適配子型表面等離子體共振(SPR)傳感器微陣列與納米金(AuNPs)信號放大技術(shù)的高特異性、高靈敏度的可實時在線檢測血小板源性生長因子(PDGF)的檢測技術(shù)。方法 利用1，4-苯二硫醇通過自組裝技術(shù)耦聯(lián)于生物芯片表面，然后在生物芯片表面修飾金納米顆粒，將采用系統(tǒng)配體進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的PDGF適配子處理后固定于SPR生物傳感器微陣列上成為檢測探針分子，然后將微陣列置于實時在線分析系統(tǒng)上對溶液中的PDGF 濃度進(jìn)行實時在線檢測；并優(yōu)化固定的核酸適配體濃度和固定條件，進(jìn)一步研究了該檢測方法的穩(wěn)定性與線性檢范圍。結(jié)果 該新型快速檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)對PDGF的快速實時檢測，穩(wěn)定性好；在0.1～50 μmol/L PDGF的范圍內(nèi)具有較好的線性，且最低檢測下限可達(dá)0.02 μmol/L。結(jié)論 該基于適配體的SPR 傳感器技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在臨床診斷工作中有著廣闊的發(fā)展前景。

適配體； 表面等離子體共振傳感器； 血小板源性生長因子； 納米金

血小板源性生長因子(PDGF)是一種最先在血小板中被發(fā)現(xiàn)的促有絲分裂劑，相對分子質(zhì)量為(28～35)×103，是由兩條多肽鏈(A、B)連接而成的同型或異型二聚體，包括PDGF-AA、 PDGF-BB、PDGF-AB 3種形式[1]。PDGF參與多種生理過程的調(diào)節(jié)，在胚胎肺分支形態(tài)發(fā)育和肺組織增殖過程中起重要作用，與肺臟多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此對其進(jìn)行檢測具有重要的臨床意義[2]。

傳統(tǒng)的PDGF檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、酶免疫測試(EIA)等。近年來也有利用生物傳感器檢測的方法報道，但基本都以抗體來實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的識別。適配體是近年來發(fā)現(xiàn)的新型識別體系，其利用系統(tǒng)配體進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從核酸分子文庫中獲得的單鏈DNA或RNA[3]。以適配體作為分子識別物質(zhì)已在蛋白質(zhì)、小分子藥物和無機離子等的檢測中得到了廣泛應(yīng)用。

納米金(AuNPs)擁有較大的比表面積，能夠提高檢測元件生物分子的固載量，在分析檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用[4]。近年來，表面等離子體共振(SPR)技術(shù)因能與適配體和AuNPs很好的結(jié)合使用，受到了廣泛的關(guān)注，并被認(rèn)為是生物分子檢測的理想檢測器件。SPR基本原理是當(dāng)金屬表面的物質(zhì)或者物質(zhì)量發(fā)生變化時,其折射率(RI)發(fā)生相應(yīng)的變化,主要表現(xiàn)為共振角的偏移[5]。利用SPR原理設(shè)計的生物傳感器具有非標(biāo)記、實時在線檢測、再生性能好、樣品無需前處理等優(yōu)點,近來已經(jīng)成為臨床檢驗領(lǐng)域研究的熱點。本研究擬將適配體與SPR傳感器微陣列技術(shù)相結(jié)合，利用適配體同靶分子結(jié)合的高特異性及與AuNPs的信號放大作用，構(gòu)建一種快速檢測PDGF的基于AuNPs信號放大的適配體型SPR生物傳感器檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 SPR生物傳感器(UMPHOA600B型，購自北京金菩嘉醫(yī)療器械有限公司)，緩沖液體系(傳感器芯片及系統(tǒng)緩沖)；Piranha緩沖液(30% H2O2∶濃H2SO4=1∶3的比例進(jìn)行配制)；血小板源性生長因子(PDGF-BB)，1,4-苯二硫醇，6-巰基-1-己醇(MCH)，AuNPs(10 nm)購自美國Sigma-Aldrich公司；PDGF適配體(PBA)為5′-NH2-(CH2)6-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3′購自大連TaKaRa公司；實驗所用水均為雙蒸水，在使用之前進(jìn)行超聲脫氣處理，并用0.22 μm微孔濾膜過濾；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生物傳感器芯片檢測元件的預(yù)處理 首先傳感器芯片于piranha緩沖液浸泡約15 min，同時于振蕩器上輕微振蕩，避免芯片表面產(chǎn)生液體氣泡，15 min后用雙蒸水充分洗滌。然后將傳感器芯片浸置于HCl中10 min以進(jìn)一步預(yù)處理，稍后用蒸餾水進(jìn)行洗滌。將傳感器芯片置于2 mL比例為V98%H2SO4∶V30%H2O2=7∶3的混合溶液中，40 ℃孵育3 h，以去除芯片上耦聯(lián)的物質(zhì)及連接于金膜的所有有機成分，同時定時振蕩離心管以除去芯片表面的氣泡。之后再將傳感器芯片置于同樣成分40 ℃混合液中，振蕩孵育3 h。最后以去離子水洗凈完全處理好的傳感器芯片，氮氣吹干，用紫外燈照射2 min，得到純金膜傳感器芯片，置于4 ℃儲存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 AuNPs與PDGF適配子層層自組裝 首先將1,4-苯二硫醇(10 mmol/L)溶解于36%乙醇中，然后將制備好的傳感器芯片浸置于其中12 h，再將AuNPs溶液振蕩混勻，將修飾有1,4-苯二硫醇的芯片置于AuNPs溶液中12 h，隨后依次使用磷酸鹽緩沖液(PBS)、蒸餾水沖洗，并用氮氣吹干。將1 μmol/L PDGF適配子溶于pH 7.4的系統(tǒng)緩沖液中，在85 ℃下加熱10 min后逐漸冷卻至室溫，以使適配體更容易結(jié)合PDGF[7]。然后將適配體溶液以50 μL/min 600 μL注入修飾好的芯片表面流池。用1 μmol/L的系統(tǒng)緩沖液配置好陰性對照后，同樣以50 μL/min 600 μL注入對照流池。待反應(yīng)充分完成后，分別以100 μL/min的速度注入0.01%十二烷基硫酸鈉(SDS)100 μL、5 mmol/L HCl 100 μL再生液到芯片表面，用以老化芯片表面；然后在37 ℃下，利用1 200 μL系統(tǒng)緩沖液以125 μL/min速度進(jìn)入流池平衡芯片表面。

1.2.3 SPR傳感器檢測 實驗中分別配制終濃度為0.05、0.1、1、5、10、50、100 μmol/L的PDGF溶液，以及空白對照組用于該傳感器檢測性能的研究。首先在流池中注入系統(tǒng)緩沖液，用來校準(zhǔn)生物傳感器基線，通過調(diào)整參數(shù)待基線顯示穩(wěn)定后，按照濃度從低到高的順序依次注入PDGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入的速度為200 μL/min，注入總量為2 500 μL。在實驗過程中通過SPR傳感器實時監(jiān)測軟件(GMPT)記錄表面等離子共振角度的變化數(shù)值。

1.2.4 適配體生物傳感器芯片的再生 當(dāng)使用的NaOH溶液濃度過高，會導(dǎo)致芯片表面已經(jīng)固定的適配體被強行解離下來, 導(dǎo)致固定在傳感器芯片表面檢測適配體數(shù)量減少, 當(dāng)在檢測下一個樣品的時候會影響檢測的靈敏度，并且非特異性吸附會增強，發(fā)生再生過程;而再生不完全, 就會出現(xiàn)一部分已經(jīng)結(jié)合的PDGF還未完全解離下來, 可供下次結(jié)合的PDGF位點就減少了，將可能導(dǎo)致高濃度樣品信號比正常檢測值偏低的情況從而影響了下次正常的檢測。本研究想利用NaOH溶液對已經(jīng)檢測使用過的芯片進(jìn)行再生。作者分別配制1、2、5 mmol/L 濃度的NaOH溶液，根據(jù)PDGF與適配體結(jié)合量的不同的(即RU值變化的大小)，采用合適濃度與量的NaOH 溶液[8]分別對傳感器芯片進(jìn)行再生性能的評估。

2 結(jié) 果

2.1 AuNPs適配子SPR生物傳感器檢測平臺的構(gòu)建與表征 構(gòu)建的SPR生物傳感器檢測平臺擁有多通道檢測池，可根據(jù)情況并行檢測6～8個標(biāo)本，并可以根據(jù)需要設(shè)定3個以內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)點；對樣品進(jìn)樣的流動速度可允許的范圍為4～418 μL/min，并可以根據(jù)情況將樣品流動速度控制在±0.5 μL/min；該檢測平臺溫度應(yīng)該控制在室溫(即25 ℃)，控制精度為±0.5 ℃。實驗中將標(biāo)本溶液逐一通過樣本檢測池，以此來調(diào)節(jié)傳感器的穩(wěn)定性。所構(gòu)建的AuNPs適配子傳感器微陣列檢測平臺與PDGF結(jié)合的檢測數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，當(dāng)實驗時間為0～800 s時，基線處于穩(wěn)定階段，SPR角度變化值穩(wěn)定。當(dāng)向檢測池中加入一定濃度的PDGF溶液后，PDGF與芯片上的適配子發(fā)生反應(yīng)，SPR傳感器檢測單元隨即檢測到SPR角度發(fā)生了非常明顯的改變。從950 s開始，SPR角的變化趨緩，說明PDGF與適配子的相互作用進(jìn)入穩(wěn)定平衡期且其結(jié)合達(dá)到了飽和狀態(tài)。實驗中從2 500 s開始使PDGF與適配子逐步進(jìn)行解離，向檢測池中通入了系統(tǒng)緩沖液，可將仍殘存在檢測管道且未與適配子結(jié)合的PDGF進(jìn)行洗脫，隨即SPR傳感器檢測到了SPR角度由70 300毫度下降至69 800毫度。最后計算洗脫后與基線的差值得出了SPR 角度的變化值。

2.2 AuNPs適配子SPR生物傳感器的線性檢測范圍 使用不同濃度的PDGF進(jìn)行實驗，得到不同的SPR傳感器實時檢測結(jié)果(圖1)。從曲線圖中可以發(fā)現(xiàn)，SPR傳感器檢測到的SPR角度變化值隨著靶標(biāo)物質(zhì)PDGF濃度的逐步變化而發(fā)生相應(yīng)的改變，實驗中當(dāng)作者將PDGF的物質(zhì)濃度從0.05 μmol/L逐步遞增至50 μmol/L時，傳感器檢測到的光學(xué)角度變化值呈現(xiàn)明顯的遞增趨勢，當(dāng)PDGF濃度增加到100 μmol/L時，傳感器檢測的光學(xué)角度變化值不再隨著濃度的增加而改變，這說明了該SPR適配體傳感器檢測限大致為0.1～50 μmol/L。

圖1 不同濃度PDGF的SPR傳感器檢測結(jié)果

2.3 納米金適配子生物芯片的再生性能 因此根據(jù)前期再生條件的摸索，本研究依據(jù)傳感器檢測信號數(shù)值的大小來確定較為合適的NaOH溶液的濃度,當(dāng)樣品濃度為3×107CFU/mL 時采用7 μL 濃度為1.5 mmol/L NaOH 溶液進(jìn)行再生, PDGF與適配體的解離效果最好, 再生后SPR折射角變化值基本恢復(fù)到上一次檢測前的基線。再生后的SPR折射角變化值與進(jìn)樣檢測前檢測基線的差值保持在±25 RU以下, 該芯片可在此條件和要求下重復(fù)使用40 次以上。

3 討 論

本研究采用了核酸適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合，并結(jié)合高靈敏度的AuNPs信號放大技術(shù)，成功構(gòu)建了對PDGF實時在線檢測的SPR生物傳感器。SPR生物傳感器方法與傳統(tǒng)檢測方法相比使用便捷、檢測速度快,同時也可連續(xù)檢測多個樣品，檢測限可達(dá)到目前通用的檢測要求，并且通過NaOH溶液再生可重復(fù)利用芯片40次以上,極大地降低了檢測成本。

為了提高現(xiàn)有SPR生物傳感器的檢測靈敏度,降低檢測限，將納米技術(shù)與SPR生物傳感器相結(jié)合,利用AuNPs顆粒生物親和性好，表面積大、可用于放大信號的特點，將AuNPs顆粒固定于生物芯片表面，用于結(jié)合更多的核酸適配體，極大地提高了SPR生物傳感器的靈敏度與檢測限。實驗結(jié)果表明，該方法檢測下限低，線性范圍寬，靈敏度高。因此該項技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測、疾病診斷、發(fā)現(xiàn)新藥等方面具有非常大的應(yīng)用價值。

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Aptamer and nanogold based surface plasma resonance biosensor microarray for rapid detection of platelet-derived growth factor*

KUANGHong，ZENGLi,LIUShu-rong，YUANLu，LIJin-feng，QINTao，JIAShu-fang，ZHOULin-yao△

(452HospitalofPLA，Chengdu，Sichuan610021，China)

Objective To construct a highly specific and highly sensitive detection techique for the real-time online detection of platelet-derived growth factor (PDGF) based on nucleic acid aptamer and nanogold (AuNPs) signal amplification technology by using surface plasmon resonance (SPR) microarray sensor.Methods 1, 4 - benzene 2 mercaptan was coupled on the biochip surface by self-assembly method . Then the modified biochip with gold nanoparticles, and immobilized PDGF aptamer screened by SELEX technology on the SPR biosensor micro array as a detecting probe was put in the real-time online analysis system for detecting the PDGF concentration in the solution. The effect of relevant experimental conditions, including the concentration of aptamer and immobilization conditions were investigated and optimized, and the stability of this detection method and the linear range were further studied. Results This novel rapid PDGF detection method realized the real time detection of PDGF with a good stability of the detection platform and a good linearity in the PDGF concentration range of 0.1-50 μmol/L,its lowest detection limit was 0.02 μmol/L. At the same time the detection system had the multichannel parallel detection ability without mutual interference. Conclusion This rapid aptamer PDGF detection technique based SPR biosensor possesses the advantages of high sensitivity and good stability, which has broad development prospect in the clinical diagnostic work.

aptamer; SPR biosensor; platelet-derived growth factor; AuNPs

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研重點項目(BWS11J067)。

匡紅，女，主管技師，碩士研究生，主要從事分子生物、生物材料、軍事醫(yī)學(xué)研究。

△通訊作者，E-mail:zlyguh123@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.007

A

1672-9455(2015)01-0016-03

2014-02-24

2014-05-12)