納米羥基磷灰石/硫酸鈣復(fù)合人工骨順鉑緩釋系統(tǒng)注射液的制備與研究*

鄭燕科，張春強(qiáng)，湯燕飛，余佳明，江 摩，湯善華(解放軍第184醫(yī)院,江西鷹潭 335000)

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·論 著·

納米羥基磷灰石/硫酸鈣復(fù)合人工骨順鉑緩釋系統(tǒng)注射液的制備與研究*

鄭燕科，張春強(qiáng)，湯燕飛，余佳明，江 摩△，湯善華(解放軍第184醫(yī)院,江西鷹潭 335000)

目的 研制可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG順鉑釋藥系統(tǒng)，為骨轉(zhuǎn)移瘤提供新型的局部藥物緩釋系統(tǒng)。方法 α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG載順鉑制成可注射用α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum緩釋微球，研究其結(jié)構(gòu)、釋藥特性、可注射性以及力學(xué)性能。結(jié)果 (1)第1、3、5、7天緩釋微球的釋藥濃度分別為97.5、90.7、83.2、68.5 μg/mL，第7天后趨于穩(wěn)定。(2)可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG順鉑釋藥系統(tǒng)在液固比為0.7時(shí)可注射性強(qiáng)，與此同時(shí)緩釋藥系統(tǒng)隨著液固比的增大凝固時(shí)間延長(zhǎng)。結(jié)論 α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG順鉑釋藥系統(tǒng)具有良好的注射性能和緩釋作用。

α-半水硫酸鈣； 順鉑； 局部藥物緩釋系統(tǒng)

局部藥物緩釋系統(tǒng)(DDS)因其能在局部達(dá)到較高的藥物濃度，同時(shí)血藥濃度低，不良反應(yīng)小，為治療骨轉(zhuǎn)移瘤提供了有效的治療用途[1-3]。羥基磷灰石(HA)作為新型生物材料問(wèn)世以來(lái)，引起了材料學(xué)科和醫(yī)學(xué)界的廣泛興趣。HA因其化學(xué)成分和晶體結(jié)構(gòu)與人體骨骼組織的主要無(wú)機(jī)礦物成分基本相同，引入人體后不會(huì)產(chǎn)生排異反應(yīng)，故其作為骨修復(fù)替代材料在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用[4]。其已被動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)具有無(wú)毒、無(wú)刺激性、良好的生物活性、生物相容性及骨傳導(dǎo)性、較高的機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[5]。而納米級(jí)羥基磷灰石(nano-HA)與半水硫酸鈣(CSH)復(fù)合體作為一種新型骨修復(fù)材料，無(wú)需二次手術(shù)其可行性已經(jīng)得到證實(shí)[2]。本研究采用具有生物活性的nano-HA作為載體，外包裹生物相容性好且可以降解的聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚體/聚乙二醇(PHBV/PEG),承載順鉑(cis-platinum)，制成nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球，再將nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum與α-CSH復(fù)合，作為人工骨材料，對(duì)其注射性能、凝固時(shí)間、藥物釋放等進(jìn)行研究，以了解其實(shí)際應(yīng)用的可行性和科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 材料 α-CSH(來(lái)自Sigma公司，γ射線(xiàn)照射滅菌)、二水硫酸鈣(CSD)、nano-HA 晶體(南京海泰納米材料有限公司)，復(fù)合材料以CSD等為促凝劑，以生理鹽水作為固化液，液/固比為0.8，α-CSH以水為固化液，液固比為0.36。聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物(PHBV)、聚乙二醇(PEG)購(gòu)自華南理工大學(xué)材料學(xué)與工程學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 nano-HA-cis-platinum的制備 以質(zhì)量比2∶1取nano-HA、cis-platinum，均勻混合，加入適量去離子水，超聲波分散25 min，在26 ℃磁力攪拌72 h。用去離子水離心洗滌3次，漿液于-80 ℃凍干，磨成粉末，得白色凍干粉nano-HA-cis-platinum[6]。

1.2.2 載藥nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球的制備 將nano-HA-cis-platinum白色凍干粉分散于含PHBV的二氯甲烷中(凍干粉與PHBV的質(zhì)量比為1∶4),并加入PEG 20000(PEG20000和PHBV的質(zhì)量比為2∶1)。然后迅速加入外相水中，其中含0.4%甲基纖維素(4 g/L w/v)，油相與水相的體積比為1∶10。劇烈攪拌至二氯甲烷完全揮發(fā)，以4 000 r/min離心15 min，過(guò)濾，水洗，收集固體冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用[7]。

1.2.3 電鏡觀察 將少量nano-HA、nano-HA-cis-platinum、nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球加入無(wú)水乙醇溶液中震蕩15 min，然后將懸浮液移到帶微柵膜的銅網(wǎng)上，乙醇揮發(fā)。 用JEOL JEM-2100高分辨透射顯微鏡進(jìn)行分析。nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球鋪于鋁箔的黏性表面，微球表面涂金，掃描電鏡觀察微球大小和表面形態(tài)。

1.2.4 nano-HA載藥效果的測(cè)定以及復(fù)合材料體外釋藥實(shí)驗(yàn) 取cis-platinum、純nano-HA以及載藥nano-HA各20 mg的樣品，溶于1 mL的二氯甲烷，加入5 mL的PBS溶液劇烈震蕩10 min，靜置1 h，然后取上清液，衍生法紫外100～400 nm全波段掃描，先確定cis-platinum的特征吸收峰為254 nm，再對(duì)比純nano-HA以及載藥nano-HA在254 nm處是否存在差異，以確定cis-platinum是否已經(jīng)載入nano-HA。在cis-platinum的特征吸收峰處運(yùn)用紫外分光光度計(jì)(UV)檢測(cè)不同濃度cis-platinum的吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回歸方程。將制得載藥復(fù)合材料90 mg室溫下浸泡于20 mL生理鹽水中，浸泡24 h。吸除浸出液，用PBS沖洗3次，更換PBS液，繼續(xù)浸泡。于第1、3、5、7、10、14、21、28天分別取樣，每次取5 mL浸泡液作為檢測(cè)樣品，同時(shí)加入5 mL新的生理鹽水，用UV檢測(cè)計(jì)算釋放藥物的質(zhì)量并繪制釋藥曲線(xiàn)。

1.2.5 可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的制備 取20 mL無(wú)菌注射器，樣品分為兩組，載藥組和未載藥組。1.0 g nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球或者1.0 g nano-HA/PHBV-PEG微球，1.0 g α-CSH，0.05 g CSD。以生理鹽水為固化液，并按液固比加入固化液并攪拌，加入固化液開(kāi)始計(jì)時(shí)。迅速攪拌均勻，1 min將漿體注入模具內(nèi)，并按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)材料經(jīng)過(guò)注射器的注射性能，同時(shí)評(píng)價(jià)樣品在不同液固比(mL/g)下的注射性能[8]。液固比值分別設(shè)定如下：載藥組0.3,0.4,0.5,0.6,0.7；未載藥組0.4,0.5,0.6,0.7，0.8。30 s注射1次，當(dāng)漿液在注射器上無(wú)法注射時(shí)定義為凝固時(shí)間。

1.2.6 釋放曲線(xiàn)繪制 以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)藥物濃度，用GraphPad Prism 5繪制nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum釋藥濃度與時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)。

1.2.7 人工骨材料注射效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 人工骨材料注射效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為佳、可、勉強(qiáng)、差和極差5個(gè)等級(jí)。佳：注射順利穩(wěn)定，材料流暢順利通過(guò)針頭；可：注射屬順利但需要施加一定推助力；材料穩(wěn)定通過(guò)針頭；勉強(qiáng)：需要較大推助力方可注射，材料不能穩(wěn)定通過(guò)針頭；差：需要大力方可將材料從針筒推出，材料在針管中頻繁受阻，注射流量極不穩(wěn)定；極差：材料很難注射或完全無(wú)法注射。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察結(jié)果 透射鏡下可見(jiàn)nano-HA為納米相晶體顆粒，尺寸為30～60 nm(圖1)。

圖1 nano-HA呈短棒狀 (透射電鏡200K)

nano-HA-cis-platinum由于晶體的凝聚和表面吸附cis-platinum以及cis-platinum顆粒疊加在一起形成二次顆粒大小在100～300 nm，平均粒徑為199.5 nm(圖2)。

注：表面吸附大量cis-platinum。

圖2 nano-HA-cis-platinum 呈晶體自然凝聚狀態(tài)

注：A為 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球(掃描電鏡×500);B為高分辨透射顯微鏡 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum形態(tài)；C為PHBV-PEG cis-platinum微球。

圖3 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球與PHBV-PEG cis-platinum微球形態(tài)

高分辨透射顯微鏡以及掃描電鏡下可見(jiàn)nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球大小均勻，表面形態(tài)一致，為多孔皺縮結(jié)構(gòu)，平均粒徑為55.4 nm，PHBV-PEG形成緩釋膜。微球破裂后大微球里面有大量小微球，小微球平均粒徑為8.1 nm(圖3)。

2.2 復(fù)合材料體外釋藥效果測(cè)定 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)cis-platinum的特征吸收峰在254 nm，而未載藥的nano-HA在此處沒(méi)有特征吸收峰(圖4)。

圖4 cis-platinum的紫外吸收光譜

在254 nm處測(cè)定10、20、40、60、80、100 μg/mL cis-platinum的吸光度，得到cis-platinum的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得其回歸方程Y=0.013 8X+0.212，R2=0.982(X為樣品濃度，Y為吸光度)(圖5)。

圖5 cis-platinum的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

第1、3、5、7天緩釋微球的釋藥濃度分別為97.5、90.7、83.2、68.5 μg/mL，第10天后趨于穩(wěn)定，體現(xiàn)出緩釋微球良好的緩釋性能,見(jiàn)圖6。

圖6 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的釋藥曲線(xiàn)

項(xiàng)目未載藥組(mL/g)0．40．50．60．70．8載藥組(mL/g)0．30．40．50．60．7注射性能差勉強(qiáng)勉強(qiáng)可佳差差勉強(qiáng)可佳凝固時(shí)間(min)35612232371525

2.3 注射性能以及凝固時(shí)間 生理鹽水作為固化液，對(duì)于未載藥組，液固比(mL/g)為0.4時(shí)不能注射，而液固比為0.5、0.6時(shí)可以勉強(qiáng)注射，為0.7、0.8時(shí)可以注射，0.8時(shí)最佳。對(duì)于載藥組而言，液固比(mL/g)為0.3、0.4時(shí)不能注射，0.5時(shí)勉強(qiáng)可以注射，0.6、0.7時(shí)可以注射，0.7時(shí)最佳。凝固時(shí)間隨著液固比的變大而變長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

3 討 論

α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG-cis-platinum釋藥系統(tǒng)以α-CSH為支架，nano-HA為載藥核心，外包裹可生物降解的PHBV及PEG高分子化合物而形成的，其較一般的局部藥物緩釋系統(tǒng)有不同的特性，良好的藥物緩釋功能，藥物爆釋不明顯[9]。這是由其結(jié)構(gòu)及組成所決定的。nano-HA//PHBV-PEG-硫酸慶大霉素微球存在大微球包裹小微球的結(jié)構(gòu)，形成了多級(jí)緩釋膜，膜表面存在大小不等的微米級(jí)或納米級(jí)的孔隙[10]，保證水分的進(jìn)入和藥物的稀釋?zhuān)籲ano-HA的表面效應(yīng)，吸附藥物能力強(qiáng)；nano-HA尺寸效應(yīng)，nano-HA之間納米級(jí)通道；外包裹降解可調(diào)控的高分子聚合物PHBV及PEG，并以α-CSH為支架[11]。

HA和CSH都是公認(rèn)的優(yōu)良成骨材料。有實(shí)驗(yàn)證明CSH/HA復(fù)合人工骨具有良好的微孔性是各種蛋白藥物的合適載體[6]。1987年Frame等嘗試將它們復(fù)合以改善單一HA材料注射性能不佳的缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩材料復(fù)合用于犬下頜骨缺損修復(fù)，獲得了協(xié)同的成骨活性：這種復(fù)合材料不僅塑形性和充填性滿(mǎn)意，其成骨性能甚至與HA自體骨相當(dāng)[7]。Shigeru等將這種復(fù)合物注射于兔脛骨骨髓內(nèi)，4周后即見(jiàn)新骨形成，8周已十分明顯。研究所用的復(fù)合人工骨系nano-HA與CSH組成，nano-HA的晶體尺度與天然骨接近，具有更好的理化及生物學(xué)性能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物降解時(shí)間適當(dāng)，具有良好的成骨活性[9]。

本研究研制了一種具有α-CSH/nano-HA與PHBV/PEG復(fù)合體材料的藥物緩釋系統(tǒng)，這樣的藥物緩釋系統(tǒng)使得順鉑的釋藥時(shí)間延長(zhǎng)，從nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的釋藥曲線(xiàn)可以看出藥物突釋不明顯。而且在合適的液固比下，藥物具有良好的注射性能。與普通的nano-HA/PHBV-PEG緩釋系統(tǒng)相比，本研究的緩釋系統(tǒng)采用α-CSH/nano-HA復(fù)合人工骨，使得順鉑緩釋系統(tǒng)具有了比較良好的成骨活性。本研究使傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物順鉑兼具藥物緩釋性能以及緩釋系統(tǒng)的良好成骨性能，為骨轉(zhuǎn)移瘤的治療提供了更為廣闊的應(yīng)用前景。

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Preparation and study of α-CSF-nano-(HA)/ PHBV-PEG cis-platinum sustained release system injection*

ZHENGYan-ke,ZHANGChun-qiang,TANGYan-fei,YUJia-ming,JIANGMo△,TANGShan-hua

(184HospitalofPLA,Yingtan,Jiangxi335000,China)

Objective To research and prepare of α-calcium sulfate hydrate(CSH)-nano-hydroxyapatite(HA)/PHBV-PEG cis-platinum drug release system to provide the new type local drug sustained release system for metastatic bone tumor.Methods Cis-platinum was loaded into n-HA by the ion exchange method.The drug loaded n-HA was mixed with CSH(1∶1) and coated with compomer poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)(PHBV) and polyethylene glycol(PEG).The injectable α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum sustained release microspheres were prepared.The release characteristics,injectability and mechanical property were researched.Results (1) The drug release concentration of the sustained release microspheres on 1,3,5,7 d the cis-platinum concentration was 97.5,90.7,83.2,68.5μg/mL respectively,and then the concentration trended to be stabilized.(2)When the liquid/solid ratio was 0.7,the injectable α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum drug delivery system has a strong injectability.At the same time the coagulation time was extended along with the increase of liquid/solid ratio.Conclusion The α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum drug delivery system has the better in vitro releasing effect and injection property.

α-calcium sulfate hemihydrate； cis-platinum； drug delivery system

南京軍區(qū)科技創(chuàng)新課題(08Z017);江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012BBG70038)。

鄭燕科，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事骨腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。△

，Email：jiangmoqq123@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.008

A

1672-9455(2015)01-0019-03

2014-04-24

2014-09-19)