習慣性流產患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17免疫失衡的檢測及其臨床意義*

楊小猛,趙 丹,杜麗偉,唐瓊玲,蔣淑萍,陳 相,陳書恩,姜艷華(.深圳市羅湖區婦幼 保健院檢驗科 5809；.深圳市羅湖區慢性病防治院檢驗科 580；.深圳市羅湖區婦幼保健院婦產科 5809)

?

·論 著·

習慣性流產患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17免疫失衡的檢測及其臨床意義*

楊小猛1,趙 丹2,杜麗偉1,唐瓊玲1,蔣淑萍1,陳 相1,陳書恩1,姜艷華3(1.深圳市羅湖區婦幼 保健院檢驗科 518019；2.深圳市羅湖區慢性病防治院檢驗科 518023；3.深圳市羅湖區婦幼保健院婦產科 518019)

目的 探討絨毛和蛻膜中調節性T細胞(Treg)/Th17免疫失衡在習慣性流產(RSA)患者免疫發病機制中的作用。方法 收集RSA患者和自愿終止妊娠的早孕婦女(正常對照組)的絨毛和蛻膜，采用流式細胞術檢測其中Treg和Th17細胞數量，采用RT-PCR檢測其中叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)和維甲酸相關核孤兒受體γt(RORγt)的mRNA水平；收集RSA患者和正常對照組的外周血，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測其中轉化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素(IL)-10、IL-17A和IL-17F的水平；統計分析Treg細胞和其相關細胞因子、Th17細胞和其相關細胞因子之間的相關性。結果 和正常對照組比較，RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細胞明顯增多(均P<0.01)，Treg細胞明顯減少(均P<0.01)，RORγt的mRNA水平明顯升高(均P<0.01)，Foxp3的mRNA水平明顯降低(均P<0.01)；RSA患者外周血中IL-17A和IL-17F水平明顯升高(均P<0.01)，TGF-β和IL-10水平明顯降低(均P<0.01)；RSA患者和正常對照組Treg細胞數量和TGF-β及IL-10水平、Th17細胞數量和IL-17A及IL-17F水平均呈正相關(均P<0.01)。結論 絨毛和蛻膜中Treg/Th17免疫失衡可能與RSA的免疫發病機制有關。

習慣性流產； Treg/Th17平衡； 轉化生長因子-β； 白細胞介素-10； 白細胞介素-17A； 白細胞介素-17F

習慣性流產(RSA)是一種由母胎免疫耐受失衡引起的疾病，育齡婦女中發病率約為1%～5%。RSA的病因十分復雜，一般認為與遺傳、解剖結構、內分泌、免疫、感染和環境因素等有關；除此之外尚有50%～60%的患者病因不明[1]。近年來研究發現，CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)和Th17細胞是不同于Th1和Th2的CD4+T細胞亞群。Treg細胞表達叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)，是一種下調免疫應答的細胞，可通過接觸抑制或分泌白細胞介素(IL)-10和轉化生長因子-β(TGF-β)發揮維持自身免疫耐受和抗炎的功能；Th17細胞表達維甲酸相關核孤兒受體γt(RORγt)，主要分泌IL-17A和IL-17F，可能在自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤等多種免疫性疾病中起重要作用[2]。Treg/Th17平衡失調與多種疾病有關[3]，而其與RSA的關系尚不明了[4]。因此，本研究將檢測RSA患者絨毛和蛻膜中Treg和Th17細胞數量、Foxp3和RORγt的mRNA水平，以及RSA患者外周血中TGF-β、IL-10、IL-17A和IL-17F等細胞因子水平，探討絨毛和蛻膜中Treg/Th17數量和功能平衡與RSA的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 RSA患者(孕周為8～10周)30例，年齡為22～38歲，平均32歲，其診斷標準參照文獻[5]。30例自愿終止妊娠的早孕婦女(孕周為8～10周)為正常對照組，年齡為23～38歲，平均31歲。兩組患者均為2013年9月至2014年5月在深圳市羅湖區婦幼保健院婦產科門診就診患者。正常對照組婦女無不良妊娠史，無遺傳、解剖結構和內分泌異常，無自身免疫性疾病史。兩組研究對象年齡和孕周差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，所有入選對象均簽訂知情同意書。

1.2 儀器與試劑 RPMI-1640培養液為美國Gibco公司產品，TRIzol試劑盒、隨機引物和RNaseH反轉錄試劑盒為美國Invitrogen公司產品，佛波脂和離子霉素為美國Sigma公司產品，固定破膜液為美國BD公司產品，細胞因子ELISA試劑盒、PE標記的抗IL-17A單抗、PE-Cy5標記的抗Foxp3單抗、PE標記的小鼠IgG1和PE-Cy5標記的小鼠IgG1均為美國eBioscience公司產品，SYBR Premix Taq試劑盒購自大連TaKaRa公司，淋巴細胞分離液購自深圳達科為公司。Coulter EPICS-XL型流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產品，ABI7300型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品，MK3型酶標儀為美國賽默飛世爾產品。

1.3 方法

1.3.1 絨毛和蛻膜單個核細胞制備 收集所有入選對象的絨毛和蛻膜，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗去除黏液和血液。無菌條件下剪碎組織，加入0.25%的胰酶-EDTA(pH8.0)于37 ℃消化1 h，獲得細胞懸液。細胞懸液中加入淋巴細胞分離液于500×g離心30 min獲得絨毛單個核細胞和蛻膜單個核細胞，并用PBS洗兩遍。為測定Th17細胞，將上述單個核細胞重懸于RPMI-1640培養液中(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酸和10%熱滅活的胎牛血清)，調整細胞濃度約為1×106/mL。加入50 ng/mL佛波脂、1 μmol/L離子霉素和1 μL/mL莫能霉素，于37 ℃、5% CO2環境中培養4 h，備用。為測定Treg細胞，將上述單個核細胞懸液直接備用。

1.3.2 流式細胞術檢測絨毛和蛻膜中Treg和Th17細胞數量 佛波脂和離子霉素下調T細胞表面CD4分子的表達，因此本實驗以CD3+CD8-IL-17+細胞定義Th17細胞；而Treg細胞被定義為CD4+CD25+Foxp3+細胞。按試劑盒步驟對Th17和Treg細胞進行熒光抗體染色，孵育完成后上流式細胞儀檢測，結果以陽性細胞所占百分比表示。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測絨毛和蛻膜中RORγt和Foxp3的mRNA水平 收集所有入選對象的絨毛和蛻膜，用PBS沖洗去除黏液和血液。無菌條件下剪碎組織，加入0.25%的胰酶-EDTA(pH8.0)于37 ℃消化1 h，參照TRIzol試劑盒說明書方法抽提總RNA，并采用隨機引物和RNase H反轉錄試劑盒生成cDNA，然后采用SYBR Premix Taq試劑盒在熒光定量PCR儀上完成擴增檢測。引物序列為Foxp3，F:5′-TCT TCC TTG AAC CCC ATG CC-3′，R:5′-AAA TGT GGC CTG TCC TGG AG-3′；RORγt，F:5′-GAG CCA AGG CTC AGT CAT GAG AA-3′，R:5′-GTC CCT CTG CTT CTT GGA CAT-3′。以上所有實驗均設置復孔檢測。mRNA定量采用相對Ct法[6]，看家基因GAPDH用作標準化，無模板標本用作無模板對照，目的基因定量公式為2-ΔCt= Power(2,-(Ct目的基因-CtGAPDH))。

1.3.4 ELISA檢測外周血細胞因子水平 收集所有入選對象外周靜脈血，800×g離心10 min分離血清備用。采用商品化的ELISA試劑盒測定血清中IL-17A、IL-17F、 TGF-β和IL-10的水平。以上所有實驗均設置復孔檢測。

2 結 果

2.1 RSA患者絨毛和蛻膜中Treg和Th17細胞數量 RSA患者絨毛和蛻膜中Treg細胞數量均分別低于正常對照組(t=7.499,P<0.01;t=6.701,P<0.01)；RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細胞數量均分別高于正常對照組(t=7.994,P<0.01;t=8.694,P<0.01)；RSA患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17比值均分別低于正常對照組(t=10.030,P<0.01;t=11.122,P<0.01)，見表1。

表1 RSA患者和正常對照組絨毛和蛻膜中Treg和Th17細胞數量比較±s)

2.2 RSA患者絨毛和蛻膜中RORγt和Foxp3的mRNA水平 RSA患者絨毛和蛻膜中Foxp3表達均明顯低于正常對照組(t=14.132,P<0.01;t=14.411,P<0.01)，而RORγt表達均明顯高于正常對照組(t=14.132,P<0.01;t=12.377,P<0.01)。其中RSA患者絨毛中RORγt表達是正常對照組的2.5倍(5.7/2.3)，蛻膜中RORγt表達是正常對照組的3.0倍(17.1/5.7)；絨毛中Foxp3表達是正常對照組的0.2倍(2.1/10.5)，蛻膜中Foxp3表達是正常對照組的0.2倍(1.5/7.5)，見表2。

2.3 RSA患者外周血中Treg和Th17相關細胞因子水平 RSA患者外周血中Treg細胞相關細胞因子TGF-β和IL-10水平均明顯低于正常對照組(t=10.691,P<0.01;t=13.182,P<0.01)，而Th17相關細胞因子IL-17A和IL-17F水平均明顯高于正常對照組(t=12.030,P<0.01;t=11.601,P<0.01),見表3。

表2 RSA患者和正常對照組絨毛和蛻膜中RORγt和Foxp3的mRNA水平比較

表3 RSA患者和正常對照組外周血Treg和Th17相關細胞因子比較

2.4 RSA患者和正常對照組絨毛和蛻膜中Treg、Th17細胞數量與外周血相關細胞因子的關系 RSA患者和正常對照組絨毛中Treg數量與外周血TGF-β、IL-10水平呈正相關(r=0.966,P<0.01;r=0.961,P<0.01)，蛻膜中Treg數量與外周血TGF-β、IL-10水平也呈正相關(r=0.955,P<0.01;r=0.952,P<0.01)；RSA患者和正常對照組絨毛中Th17數量與外周血IL-17A、IL-17F水平呈正相關(r=0.961,P<0.01;r=0.953,P<0.01)，蛻膜中Th17數量與外周血IL-17A、IL-17F水平也呈正相關(r=0.967,P<0.01;r=0.972,P<0.01)。

3 討 論

RSA是目前難治性不育中急需解決的問題，一般認為與染色體異常、內分泌失調、生殖結構畸形和感染有關；此外尚約有60%～70%患者原因不明，研究發現RSA患者體內免疫失衡可能是重要原因之一。Treg和Th17細胞是近年來新發現的不同于Th1、Th2的CD4陽性T細胞亞群，Treg細胞是一種下調免疫應答的細胞，表達Foxp3并通過接觸抑制或分泌IL-10和TGF-β等細胞因子發揮維持自身免疫耐受和抗炎的功能；Th17細胞表達RORγt，主要分泌IL-17A和IL-17F，可能在自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤等多種免疫性疾病中起重要作用[2]。研究表明，Treg/Th17平衡失調與多種疾病有關[3]，而其與RSA的關系目前尚不清楚。

正常的母胎免疫耐受是成功的妊娠過程的有力保證，正常孕婦的母胎免疫耐受既能抵抗微生物感染又不排斥表達半同種異體父系抗原的胚胎或胎兒[7]。Treg細胞是一群獨特的CD4+T細胞亞群，具有免疫抑制功能，介導體內的免疫抑制效應，是維持免疫耐受和控制免疫應答的重要細胞。Treg細胞數量降低與機體受損的免疫內環境穩定和自身免疫性疾病的發生有關[8]。正常妊娠的小鼠和人類Treg細胞數量明顯增多，在母體免疫細胞首次接觸胎兒抗原是起關鍵的保護作用。Treg細胞增殖不足的小鼠有流產傾向，而正常妊娠小鼠的Treg細胞的增殖能力較高；有流產傾向的小鼠經過繼免疫來自正常妊娠小鼠的Treg細胞能夠阻止自發流產的發生[9]。本研究發現，RSA患者絨毛和蛻膜中Treg細胞數量和Foxp3的mRNA水平均低于正常對照組，其外周血中TGF-β和 IL-10水平也均低于正常對照組；同時，RSA患者和正常對照組的絨毛和蛻膜中Treg細胞數量與外周血中TGF-β和 IL-10水平呈正比?；罨腡reg細胞能分泌包括TGF-β和 IL-10等大量的免疫抑制因子，而TGF-β和 IL-10參與調節Treg細胞的數量和功能，TGF-β是維持Treg細胞數量和功能的關鍵因子，IL-10能誘導Treg細胞的產生[10]。因此，本研究結果提示，RSA患者絨毛和蛻膜中Treg細胞數量減低和功能缺陷減弱了患者的免疫抑制功能，并與自發性流產的發生密切相關。

Th17細胞是另一群不同于Th1、Th2和Treg細胞的CD4+T細胞，分泌IL-17A、IL-17F、 IL-22和IL-26等細胞因子，原始CD4+T細胞在TGF-β、IL-6、IL-23和IL-1的作用下分化為Th17細胞[11]。Th17細胞可能在自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤等多種免疫性疾病中起重要作用[12]。本研究發現，RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細胞數量和RORγt的mRNA水平均高于正常對照組，其外周血中IL-17A和 IL-17F水平也均高于正常對照組；同時，RSA患者和正常對照組的絨毛和蛻膜中Th17細胞數量與外周血中IL-17A和 IL-17F水平呈正比。IL-17通過介導中性粒細胞浸潤，激活IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、NO、基質金屬蛋白酶、NF-κB配體的受體活化劑和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子而引發炎癥反應[13]。因此，本研究結果提示，RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細胞數量增多和過度的功能活化增強了患者的炎癥反應，并與自發性流產的發生密切相關。

近年來Treg/Th17平衡與妊娠的關系受到廣泛重視，研究發現RSA患者外周血和蛻膜中Treg細胞明顯減少[14]，作者前期研究也證實RSA患者外周血Treg細胞數量低下且免疫下調性細胞因子TGF-β和IL-10水平降低[15]。本研究發現，RSA患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17比值明顯低于正常對照組。Th17和Treg細胞來自同樣的前體細胞，原始CD4+T細胞在TGF-β和IL-6刺激下分化為Th17細胞而在TGF-β刺激下分化為Treg細胞；同時Treg細胞轉錄因子Foxp3和Th17細胞轉錄因子RORγt能夠相互抑制對方的功能。因此，本研究結果提示，Treg/Th17平衡失調與自發性流產的發生有關。

總之，本研究結果表明絨毛和蛻膜中Treg/Th17數量和功能平衡在維持正常妊娠中發揮重要作用，絨毛和蛻膜中Treg/Th17數量和功能失衡可能參與RSA免疫發病機制。探討絨毛和蛻膜中Treg/Th17細胞數量和功能平衡與RSA發病機制的關系，將可能為診斷和治療RSA的治療提供理論和實驗依據。

[1]Bubanovic IV.Induction of thymic tolerance as possibility in prevention of recurrent spontaneous abortion[J].Med Hypotheses，2003，60(4):520-524.

[2]Peiser M.Role of Th17 cells in skin inflammation of allergic contact dermatitis[J].Clin Dev Immunol，2013，2013:261037-261039.

[3]Galati D,De Martino M,Trotta A,et al.Peripheral depletion of NK cells and imbalance of the Treg/Th17 axis in idiopathic pulmonary fibrosis patients[J].Cytokine，2014，66(2):119-126.

[4]Wang WJ,Liu FJ,Qu HM,et al.Regulation of the expression of Th17 cells and regulatory T cells by IL-27 in patients with unexplained early recurrent miscarriage[J].J Reprod Immunol，2013，99(1/2):39-45.

[5]Lin QD,Qiu LH.Pathogenesis,diagnosis,and treatment of recurrent spontaneous abortion with immune type[J].Front Med China，2010，4(3):275-279.

[6]Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J].Nat Protoc，2008，3(6):1101-1108.

[7]Gobert M,Lafaille JJ.Maternal-fetal immune tolerance,block by block[J].Cell,2012,150(1):7-9.

[8]Sakaguchi S,Yamaguchi T,Nomura T,et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell，2008，133(5):775-787.

[9]Yin Y,Han X,Shi Q,et al.Adoptive transfer of CD4+CD25+regulatory T cells for prevention and treatment of spontaneous abortion[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2012，161(2):177-181.

[10]Wang BL,Su H,Chen Y,et al.A role for trichosanthin in the expansion of CD4CD25 regulatory T cells[J].Scand J Immunol，2010，71(4):258-266.

[11]Yang L,Anderson DE,Baecher-Allan C,et al.IL-21 and TGF-beta are required for differentiation of human T(H) 17 cells[J].Nature，2008，454(7202):350-352.

[12]Qi W,Huang X,Wang J.Correlation between Th17 cells and tumor microenvironment[J].Cell Immunol，2013，285(1/2):18-22.

[13]Zhao L,Tang Y,You Z,et al.Interleukin-17 contributes to the pathogenesis of autoimmune hepatitis through inducing hepatic interleukin-6 expression[J].PLoS One,2011, 6(4):e18909.

[14]Wang WJ,Hao CF,Yi L,et al.Increased prevalence of T helper 17(Th17) cells in peripheral blood and decidua in unexplained recurrent spontaneous abortion patients[J].J Reprod Immunol，2010，84(2):164-170.

[15]楊小猛,趙丹,陳書恩,等.CD4+CD25+Treg 細胞、TGF-β和IL-10在反復自然流產中的變化[J].醫藥論壇雜志，2011，32(12):19-21.

Immune unbalance detection of Treg / Th17 in villus and deciduas in patients with habitual abortion and its clinical significance*

YANGXiao-meng1,ZHAODan2,DULi-wei1,TANGQiong-ling1,JIANGShu-ping1,CHENXiang1,CHENShu-en1,JIANGYan-hua3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,LuohuDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen,Guangdong518019,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,LuohuDistrictChronicDiseasePreventionandCureHospital,Shenzhen,Guangdong518023,China; 3.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,LuohuDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen,Guangdong518019,China)

Objective To investigate the role of immune unbalance of Treg/Th17 in villus and decidua on the immunopathogenesis in recurrent spontaneous abortion(RSA).Methods The villus and decidua specimens were collected from the patients with RSA and early pregnancy women of voluntarily terminating pregnancy(normal control group).The Treg/Th17 cell count was detected by the flow cytometry.The RT-PCR method was adopted to detect the mRNA levels of RORγt and Foxp3 in villus and decidua.The levels of peripheral blood IL-17A,IL-17F,TGF-β and IL-10 in the two groups were detected by ELISA.Finally,the correlations between Treg cells with the related cytokines and between Th17 cells with the related cytokines were statistically analyzed.Results Compared with the normal control group,the Th17 cells in villus and decidua in the patients with RSA were significantly increased(P<0.01),while the Treg cells were significantly decreased(P<0.01),the mRNA level of RORγt was significantly increased(P<0.01) and the mRNA level of Foxp3 was significantly decreased(P<0.01); the peripheral blood IL-17A and IL-17F levels in the RSA patients were significantly increased(P<0.01) and the TGF-β and IL-10 levels were significantly decreased(P<0.01).The Treg cells quantity was positively correlated with the peripheral blood TGF-β and IL-10 levels and the Th17 cells quantity was positively correlated with peripheral blood IL-17A and IL-17F levels in the RSA patients and the normal control group(P<0.01).Conclusion The imbalance of Treg/Th17 in villus and decidua may be related with the immunopathogenesis of RSA.

Recurrent spontaneous abortion; Balance of Treg/Th17; TGF-β; IL-10; IL-17A; IL-17F

廣東省深圳市科技計劃項目(醫療衛生類)(201203194)。

楊小猛，男，副主任技師，博士，主要從事分子免疫學和生殖免疫學基礎研究工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.009

A

1672-9455(2015)01-0022-04

2014-05-03

2014-09-21)