兩種核酸提取方法對丙型肝炎病毒RNA檢測效果的比較及應用評價

范公忍,陳天寶，李 冰,胡學玲,曹建彪(北京軍區總醫院肝病治療中心,北京 100700)

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·論 著·

兩種核酸提取方法對丙型肝炎病毒RNA檢測效果的比較及應用評價

范公忍,陳天寶，李 冰,胡學玲,曹建彪(北京軍區總醫院肝病治療中心,北京 100700)

目的 比較兩種核酸提取方法對實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)檢測丙型肝炎病毒(HCV)RNA病毒載量的影響。 方法 選擇89例2012年10月至2013年6月在肝病中心住院的慢性丙型肝炎抗-HCV陽性患者，分別用磁珠法和TRIZOL法提取血清標本中HCV RNA，用FQ-PCR技術檢測HCV RNA,并對結果進行對比分析，統計學處理采用χ2檢驗和t檢驗。 結果 89例抗HCV陽性標本中以磁珠法提取核酸進行HCV RNA定量檢測的陽性率為73.0%(65/89)，以TRIZOL法提取核酸進行HCV RNA定量檢測的陽性率為65.1%(58/89)，兩法提取方法檢測陽性率比較有統計學意義(χ2=3.76，P<0.05)。兩法所測濃度結果換算成對數值，經t檢驗兩者差異無統計學意義(t=0.32，P>0.05)。結論 兩種方法均可獲得較高的回收率、有較高的敏感度和特異度，磁珠法提取HCV RNA可用于HCV感染者的臨床診斷和療效觀察。

丙型肝炎； 核酸提取； 熒光定量聚合酶鏈反應； 靈敏度

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種隱匿性、持續性、進展性疾病。在我國每年新發丙型肝炎病例約為3.5萬例，部分患者晚期可發展為肝硬化或肝細胞癌[1]。因此，及早發現并給予有效的抗病毒治療是丙型肝炎現癥患者治療的關鍵措施。血清HCV RNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)檢測可以反映HCV感染者病毒復制情況，對于HCV患者臨床用藥、療效監測及預后判斷均具有重要的意義[2]。定量PCR檢測結果的準確性與核酸的提取方法不同而有較大差別，不同的核酸提取方法會直接影響PCR擴增效果和檢測準確性[3]。因此，迫切需要一種快速、可靠的核酸提取方法以滿足臨床診斷與治療的需求。本研究分別采用磁珠法和TRIZOL法提取89例抗-HCV陽性的臨床患者血清中HCV RNA，FQ-PCR法測定標本中HCV RNA載量，比較兩種提取方法檢測結果的一致性、靈敏度和相關性，觀察其臨床應用效果，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年10月至2013年6月本院肝病中心住院診斷確診為慢性丙型肝炎患者血清共89例，其中男33例，女56例，年齡25～78歲,中位年齡42歲。所有患者均符合中華醫學會修訂的《丙型肝炎防治指南》診斷標準[4]。治療前采用化學發光法檢測抗HCV均陽性，并排除甲、乙、丁、戊型肝炎病毒感染者。所有觀察病例均清晨空腹抽取靜脈血3 mL,離心后分離血清轉移至無菌凍存管，-80 ℃冰箱保存，統一檢測。

1.2 試劑與儀器 磁珠法提取試劑由上海之江生物科技有限公司提供(批號20121001)；TRIZOL法提取試劑由天根生化(北京)科技有限公司提供(批號20130505)；HCV RNA定量試劑由上海之江生物科技有限公司提供(批號20121001)，試劑盒最低檢測限為HCV RNA≥5.00×102copy/mL為陽性；質控品為衛生部臨床檢驗中心提供的HCV定量標準品(批號20061221)；儀器為德國Roche診斷有限公司LightcyclerTM熒光定量PCR儀，使用美國Beckman公司Microfgezzr高速冷凍離心機和Eppendorf微量加樣器。

1.3 實驗方法

1.3.1 磁珠法提取HCV RNA (1)磁珠與標本親和：將50 μL待檢血清加入150 μL樣品結合液充分混勻后，漩渦振蕩10 s，使磁珠均勻分散至緩沖液中，完全裂解病毒外殼膜蛋白，并使裸露RNA與磁珠結合，靜置10 min。(2)分離磁珠：吸取分離液300 μL于結合柱中，混勻，靜置3 min后，13 000×g離心40 s，棄去收集管廢液。(3)洗滌磁珠:各取200 μL洗滌液A和洗滌液W于樣品管中，13 000×g離心15 s洗滌1次，棄去廢液。(4)解離收集RNA:將親和柱放入1.5 mL無RNAnase離心管中加入65 ℃預熱洗脫液，靜置2 min后，13 000×g離心2 min，RNA被洗脫于離心管中，混勻后取5 μL作為PCR反應模板。

1.3.2 TRIZOL法提取HCV RNA 將50 μL待檢血清加入150 μL Trizol溶液旋渦混勻，再加入50 μL氯仿(-20 ℃預冷)震蕩混勻后，13 000×g離心10 min，吸取上清液于另一離心管中，加入與上清等量的異丙醇(-20 ℃預冷)，混勻后室溫下靜置10 min，然后13 000×g離心15 min，棄去上清液，加入300 μL 75%乙醇(-20 ℃預冷),混勻后，1 3000×g 離心10 min，吸干上清液，空氣干燥5 min，然后加入20 μL無RNA酶水溶解混勻，取5 μL作為PCR反應模板。

1.3.3 HCV RNA定量試驗 兩種方法提取的核酸模板均采用上海之江生物科技有限公司提供的HCV RNA定量試劑進行平行檢測,每次操作均設陰、陽對照及室內質控。PCR擴增反應條件：反轉錄程序42 ℃ 30 min，然后按照94 ℃ 2 min,93 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s，40個循環擴增，72 ℃ 5 min延伸。擴增結束時，儀器根據標準曲線自動給出檢測結果數值。

1.3.4 敏感度比較 將已知HCV RNA強陽性質控品(5.0×107copy/mL)血清1份,用10%小牛血清按10倍梯度系列稀釋,獲得數個濃度的系列稀釋血清，分別用上述兩種方法提取稀釋后標本中的總HCV RNA，經PCR擴增后，根據檢測到的最低值確定兩種方法的敏感度和線性關系。

1.3.5 重復性比較 取上述中等載量的HCV RNA標本1份，分別用上述兩種方法各提取HCV RNA 5次，進行熒光定量PCR檢測，定量結果換算成對數值，計算兩種方法的批內變異系數[CV(%)]，比較兩種方法提取標本測定結果的重復性。

1.4 統計學處理 用SPSS17.0統計軟件和Excel軟件對結果進行統計學分析，PCR檢測血清HCV RNA結果以10為底數轉換成對數形式計算比較，組間比較采用配對t檢驗，率的比較采用χ2檢驗；兩種方法指標間相關性程度檢測采用Pearson關聯性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩種提取方法HCV RNA濃度和純度比較 將磁珠法和TRIZOL法所制備的總HCV RNA，加入TE緩沖液50 μL,用紫外分光光度儀測定濃度和純度(A260/280比值為1.8～2.0)。取5 μL提純總mRNA標本將0.8%甲醇固定后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見28s和18s兩個亞基，與標準mRNA質控品對照電泳圖位置一致(圖1)。結果證實磁珠法和TRIZOL法提純的RNA模板純度較好，在提取過程中未丟失、污染或降解。

注：1～3泳道磁珠法；4～6泳道TRIZOL法；M:質控品對照。

圖1 HCV RNA純度瓊脂糖電泳圖譜

2.2 臨床標本結果比較 分別用兩種核酸提取方法檢測臨床抗HCV陽性患者血清89例，其中磁珠法陽性率73.0%(65/89)，對數平均值(5.37±1.62)copy/mL；TRIZOL法陽性率65.1%(58/89)，對數平均值(5.15±1.80)copy/mL。結果顯示磁珠法提取核酸標本的檢測結果高于TRIZOL法，差異有統計學意義(χ2=3.76，P<0.05)。兩法檢測結果取對數值作圖顯示具有較好的相關性(r=0.925)，見圖2。

圖2 磁珠法與TRIZOL法檢測HCV RNA結果比較

方法原濃度10-110-210-310-410-510-610-7磁珠法7．146．105．274．123．803．152．782．52TRIZOL法6．975．925．444．954．483．973．49-

注：-表示低于最低檢測限。

圖3 兩種提取方法檢測HCV RNA敏感度比較

2.3 敏感度比較 磁珠法最低檢測限為10-7copy/mL，TRIZOL法最低檢測限為10-6copy/mL水平，兩者比較磁珠法敏感度略高于TRIZOL法，對于測定值在10-4以下的低濃度HCV RNA標本，磁珠法提取核酸檢測下線更靈敏；將兩法所測濃度結果換算成對數值，兩種核酸提取方法檢測結果的敏感度比較差異無統計學意義(t=0.32，P>0.05)(圖3)。

2.4 重復性比較 用磁珠法提取核酸標本檢測HCV RNA的結果優于TRIZOL法(表2)。

表2 兩種核酸提取方法檢測HCV RNA的重復性比較

3 討 論

病毒核酸檢測技術中核酸提取是最重要的環節之一，由于HCV為單股正鏈線狀RNA病毒，其基因組具有高度的多態性和變異性，容易受到RNA酶的破壞而降解[5]。因此，在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染。HCV RNA擴增過程需要將mRNA反轉錄為cDNA，其中轉錄酶活性及模板的得率多少均影響定量結果的準確度[6-7]。目前由于國內HCV定量檢測核酸提取純化方法不標準，且參與擴增模板標本量少(5 μL)及反應體系量不足(20～40 μL)；擴增過程中沒有內標作參考，缺乏對假陰性結果的監控，導致各醫療單位檢測結果無法參考比較[8]。因此，選擇質量好且符合自己試驗要求，并與本實驗室儀器相配備的試劑，對于保障試驗結果的準確度非常重要。

本研究分別采用磁珠法和TRIZOL法提取89例抗-HCV陽性患者血清中HCV RNA，為保證試驗結果的可比性，試驗設計除核酸提取方法不同外，其余操作過程、模板上樣量及擴增試劑均相同，并在同一擴增儀上同時檢測。結果顯示磁珠法核酸檢測結果陽性率為73.0%(65/89)，TRIZOL法陽性率為65.1%(58/89)。結果表明這兩種核酸提取方法均可以通過提純獲得較好的核酸模板，在相同的檢測條件下，檢測結果敏感度相近，都能滿足臨床需要，磁珠法檢測結果略優于TRIZOL法。磁珠法是利用磁球顆粒活性基團在一定條件下可與核酸結合與解離的原理，盡可能地避免了提取過程中核酸的丟失，還能很好地去除標本中可能存在的干擾物質(如血紅蛋白，膽紅素及高血脂等因素)影響，使核酸模板得到較好的純化[9]，尤其對臨界值附近的低濃度HCV標本提取效果更好，磁珠法比TRIZOL法提取的標本檢測限更低，敏感度更好；用磁珠法處理標本所得定量結果能更好地反映出標本之間的倍比稀釋關系。TRIZOL法操作步驟繁瑣，需將液體多次轉移、容易造成核酸的丟失，加之本研究應用的是國產TRIZOL試劑，可能與進口試劑之間也存在著差異。這可能是TRIZOL法提取的標本在擴增效率、敏感度和重復性等方面略低于磁珠法的原因。鐘海軍等[10]曾報道比較了不同核酸提取HCV RNA的效果，結果顯示磁珠法提取的核酸標本具有較好的擴增效率，線性關系和可重復性均高于常規的酚-氯仿提取法。本文檢測結果進一步證實了磁珠法提取核酸純度高、檢測結果準確度好的優點，但還需要擴大標本量進行深入的研究。

干擾素(IFN-α)是目前臨床抗HCV治療的首選藥物。隨著治療時間的延長，大部分患者血清中HCV RNA載量檢測報告“低于最低檢測限”水平。但這部分患者并非真正意義上的病毒完全清除，而是由于病毒提取方法的缺陷或儀器檢測靈敏度不夠，不能檢測出尚存的低載量HCV RNA所致[11]。因此，必須重視低載量HCV RNA標本的提取與檢測，保障臨床檢測結果報告的準確度，使肝細胞癌患者盡可能達到理想的治療目標，為調整用藥劑量及治療時間，制訂個體化的治療方案提供指導[12]。

本研究結果顯示，磁珠法是一種操作簡便、純化效率高的提取方法，可應用于HCV感染者的臨床診斷和療效監測，尤其在HCV RNA載量處于低濃度水平時，該方法可將全部核酸標本參與到PCR反應過程中，最大限度地減少了核酸丟失，結果敏感度高、準確度好，對于檢測慢性丙型肝炎患者血清中低載量HCV RNA水平比TRIZOL法具有更好的應用前景。

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Comparison of effects between two kinds of nucleic acid extraction method for detecting HCV RNA and their application evaluation

FANGong-ren,CHENTian-bao,LIBing,HUXue-ling,CAOJian-biao

(TherapyCenterforLiverDiseases,GeneralHospitalofBeijingMilitaryRegion，Beijing,100700,China)

Objective To compare the influences of two kinds of nucleic acid extraction method for detecting hepatitis C virus(HCV) RNA viral load by the real-time fluorescenct quantitative(FQ) PCR.Methods 89 inpatients with chronic hepatitis C(CHC) and anti-HCV positive in the Therapy Center for Liver Diseases of our hospital from October 2012 to June 2013 were selected and HCVRNA was extracted from the serum specimens by using the magnetic beads and Trizol methods.FQ-PCR was adopted for detecting serum HCV RNA.The detected results were performed the comparative analysis.The statistic processing adopted the χ2test andttest.Results The positive rate of serum HCV RNA extracted by the magnetic beads and Trizol methods were 73.0%(65/89) and 65.1%(58/89) respectively,and the difference between the two methods showed the statistical significance(χ2=3.76,P<0.05).By converting the concentration results detected by these two methods into the log values,there was no statistically significant difference between the two methods(t=0.32,P>0.05).Conclusion The two kinds of method can obtain the higher recovery rate with higher sensitivity and higher specificity.The magnetic beads method for extracting HCV RNA could be used in the clinical diagnosis and therapeutic observation in the HCV infected persons.

hepatitis,C; nucleic acid extraction; fluorescent quantitative PCR; sensitivity

范公忍，男，副主任技師，大學本科/醫學學士，主要從事慢性肝病發病機制和臨床診治研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.018

A

1672-9455(2015)01-0048-03

2014-03-16

2014-08-02)