宮頸脫落細胞DKK-3基因甲基化在宮頸癌中的意義

胡 玲，姜 玲，胡 姣，張 婧(.武漢市青山區第一醫院婦產科 430080；2.湖北省襄陽市中心醫院婦產科 4402)

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·臨床研究·

宮頸脫落細胞DKK-3基因甲基化在宮頸癌中的意義

胡 玲1，姜 玲1，胡 姣1，張 婧2△(1.武漢市青山區第一醫院婦產科 430080；2.湖北省襄陽市中心醫院婦產科 441021)

目的 檢測宮頸脫落細胞Dickkopf相關蛋白3(DKK-3)基因啟動子甲基化并研究其在宮頸癌中的臨床意義。方法 選擇宮頸癌患者(CER組)和健康女性(CON組)為研究對象，采用甲基化特異性PCR(MSP)檢測兩組研究對象宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化，比較DKK-3基因啟動子甲基化率在不同臨床病理因素中的差異。結果 CER組宮頸癌患者宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于CON組健康女性(53.8%vs. 0.0%，P<0.01)。CER組宮頸癌患者宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化率在HPV感染、組織學分級、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移和國際婦產科聯盟(FIGO) 分期中的差異均有統計學意義(均P<0.05)，有HPV感染、組織學分級高、腫瘤最大徑大于或等于4 cm、有淋巴結轉移、有遠處轉移和FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于無HPV感染、組織學分級低、腫瘤最大徑小于4 cm、無淋巴結轉移、無遠處轉移和FIGO分期早的患者。結論 宮頸癌患者宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化與HPV感染、組織學分級、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移和FIGO分期有關，可用于評估宮頸癌的病情嚴重程度和預后。

宮頸癌； DKK-3； 甲基化

目前對宮頸癌的發病機制尚未完全明確，研究表明其與抑癌基因的甲基化沉默有關，這些基因的甲基化率與宮頸癌的病程嚴重程度和預后緊密相關[1-2]。Dickkopf相關蛋白3(DKK-3)是新近發現的抑癌基因，其甲基化沉默時導致失去對細胞周期的調控而發生癌變，與腫瘤的發生、進展與轉歸緊密相關[3]。研究表明，在宮頸癌組織中可檢測到DKK-3高甲基化狀態[4]。本研究檢測宮頸癌患者宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化狀態，研究宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化在宮頸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014年1月診治的宮頸癌患者為研究對象(CER組)。納入標準：(1)初治患者，既往未行化療及手術治療；(2)經臨床表現、體格檢查、影像學及病理組織學檢查確診；(3)排除合并嚴重心腦肺及其他腫瘤患者。共納入65例研究對象，平均年齡(47.3±6.5)歲；病理類型為鱗狀細胞癌48例，腺癌11例，腺鱗癌6例；國際婦產科聯盟(FIGO) (2009年)宮頸癌分期包括Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。另以同期50例健康女性為對照(CON組)，平均年齡(47.5±7.1)歲。CER組和CON組研究對象年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 材料與試劑 宮頸脫落細胞獲取：將宮頸刷在子宮頸外口與頸管交界處刷轉，收集子宮頸脫落細胞，然后將宮頸涂片取樣器放入裝有特殊溶液的試管中，輕輕搖動，使取樣器上的細胞標本洗脫在溶液中。DNA提取試劑購自寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；甲基化檢測購于北京天漠公司。

1.3 DKK-3基因啟動子甲基化檢測 根據DNA提取試劑操作說明提取CER組和CON組宮頸脫落細胞總DNA。采用MSP法檢測DKK-3基因啟動子甲基化，引物序列參考Ding等[5]文獻報道序列。PCR反應體系為25 μL，循環條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性1 min，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環，最后72 ℃延伸8 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

2 結 果

2.1 DKK-3基因啟動子甲基化 CER組65例宮頸癌患者宮頸脫落細胞檢測到35例呈甲基化狀態，甲基化率為53.8%，CON組50例健康女性中均未檢測到甲基化狀態，甲基化率為0.0%，CER組宮頸癌患者宮頸脫落細胞DKK-3基因甲基化率明顯高于CON組健康女性(χ2=36.200，P<0.01)。

2.2 DKK-3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系 CER組宮頸癌患者的宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化率在年齡和病理類型中的差異均無統計學意義(均P>0.05)，在HPV感染、組織學分級、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移和FIGO分期中的差異均有統計學意義(均P<0.05)，有HPV感染、組織學分級高、腫瘤最大徑大于或等于4 cm、有淋巴結轉移、有遠處轉移、FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于無HPV感染、組織學分級低、腫瘤最大徑小于4 cm、無淋巴結轉移、無遠處轉移和FIGO分期早的患者。結果見表1。

表1 CER組宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化與臨床病理因素關系

續表1 CER組宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化與臨床病理因素關系

3 討 論

基因甲基化是表觀遺傳學中與堿基突變無關的轉錄前基因調控機制，甲基化CG結合甲基結合蛋白或自身結構可阻遏轉錄因子形成轉錄復合物從而調控基因表達，而基因甲基化主要集中在含CpG島的基因啟動子區域[6]。研究表明，抑癌基因啟動子甲基化沉默導致其失去對正常細胞增殖的調控而發生癌變，與腫瘤的發病機制、轉歸及預后密切相關，越來越多的研究表明抑癌基因啟動子甲基化可用于腫瘤的病情及預后評估[7-8]。DKK-3基因屬于DKK家族，為Wnt信號傳導通路的抑制因子，具有促進細胞凋亡和調控腫瘤血管產生的功能，在消化系統腫瘤和呼吸系統腫瘤等可檢測到其處于甲基化狀態，且其甲基化率可反映病情嚴重程度和預后[9]。目前對宮頸癌的發病機制尚未完全明確，研究表明其與抑癌基因的甲基化失活有關，隨著研究的不斷深入，越來越多的基因被發現參與宮頸癌的發生、發展[10]。研究表明，宮頸癌組織中可檢測到DKK-3基因啟動子甲基化狀態，其甲基化率明顯高于正常組織[4]，因宮頸脫落細胞篩查宮頸癌較宮頸切除組織病理學更方便、快捷，檢測宮頸脫落細胞DKK-3基因甲基化狀態對宮頸癌的篩查更有臨床價值。本研究表明宮頸癌患者宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于健康女性，證實DKK-3基因甲基化在宮頸癌發病機制中的作用。

目前公認的宮頸癌病情及預后的決定因素為組織學分級、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移和FIGO分期，組織分化程度低、腫瘤越大、有淋巴結轉移、有遠處轉移和FIGO分期晚的患者其生存期越差，此外，研究表明宮頸癌患者的生存質量同樣與這些因素密切相關。本研究發現宮頸癌患者的宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化率在HPV感染、組織學分級、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移和FIGO分期中的差異均有統計學意義(均P<0.05)，有HPV感染、組織學分級高、腫瘤最大徑大于或等于4 cm、有淋巴結轉移、有遠處轉移、FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于無HPV感染、組織學分級低、腫瘤最大徑小于4 cm、無淋巴結轉移、無遠處轉移和FIGO分期早的患者。這些證據表明，與宮頸癌術后切除病理組織一樣，宮頸脫落細胞DKK-3基因啟動子甲基化與宮頸癌的病情及預后緊密相關，可作為其病情及預后評估的標志物。宮頸脫落細胞篩查宮頸癌較傳統的宮頸活檢更具有臨床價值，同時可在術前提供客觀證據，這點是傳統的病理組織學無法企及的。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.045

A

1672-9455(2015)01-0110-02

2014-04-22

2014-07-12)

△通訊作者，E-mail：mirror1219@sohu.com。