云南漢族人群Tim-3啟動子區-1516G>T位點多態性與系統性紅斑狼瘡關聯性研究*

高 輝，彭傳梅，付曉野，曹向紅，董玉琳，王 楊(昆明醫科大學附屬延安醫院醫學檢驗科，昆明 650051)

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云南漢族人群Tim-3啟動子區-1516G>T位點多態性與系統性紅斑狼瘡關聯性研究*

高 輝，彭傳梅△，付曉野，曹向紅，董玉琳，王 楊(昆明醫科大學附屬延安醫院醫學檢驗科，昆明 650051)

目的 探討T細胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白(Tim)-3啟動子區-1516G>T位點基因多態性與云南高原地區漢族人群系統性紅斑狼瘡(SLE)的遺傳易感性及其相關自身抗體的表達有無關聯。方法 采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應方法對132例云南漢族SLE患者和120例健康體檢者Tim-3啟動子區多態性位點-1516G>T的基因多態性進行檢測，同時采用間接免疫熒光法和線性免疫印跡法檢測其雙鏈DNA抗體、Sm抗體、核糖核蛋白抗體三種自身抗體。采用直接計數法計算基因型和等位基因頻率，進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，基因型和等位基因頻率的組間比較、各自身抗體和基因型的相關性比較均采用χ2檢驗。結果 云南漢族人群Tim-3啟動子區多態性位點-1516G>T的基因型GG、GT、TT在SLE組頻率為：0.818 2、0.181 8、0.000 0，在對照組頻率為：0.916 7、0.075 0、0.008 3，其基因型和等位基因頻率在兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。結論 云南漢族人群Tim-3啟動子區-1516位點存在單核苷酸多態性變異，且其多態性變異與系統性紅斑狼瘡遺傳易感性相關，但其不同基因型可能不會影響SLE相關自身抗體的表達。

系統性紅斑狼瘡； T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3； 基因多態性； 遺傳易感性

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種臨床表現多樣、涉及機體許多系統和臟器的自身免疫性疾病，其發病率在種族、地區上差別很大。SLE的病因和發病機制尚未完全清楚，一般認為遺傳、環境等為其發病誘因。T細胞在SLE的發病過程中扮演重要角色，在其發病的不同環節均存在輔助性T細胞(Th)1/Th2的不平衡性[1]。T細胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白(Tim)基因家族是Mcintire等[2]于2001年發現的一個新的基因家族。小鼠Tim家族基因共有8個成員(Tim 1～8)，人Tim家族基因與小鼠有高度的同源性，在人類Tim家族發現只有3個基因，分別為Tim-1、Tim-3和Tim-4，無Tim-2，定位于染色體5q33.2區域。人Tim-3基因全長約23 kb，包含有7個外顯子，編碼產物為301個氨基酸。Monney等[3]用定量RT-PCR方法檢測Tim-3基因在許多細胞系(Th1、Th2、DCs、B細胞)以及SJL小鼠的T、B、CD11b+細胞上的表達，發現Tim-3 mRNA只高表達于Th1細胞。由此表明Tim-3是重要的免疫調節分子，在自身免疫性疾病等Th1/Th2相關性疾病中發揮重要作用。國內外研究顯示，人類Tim-3的啟動子區和編碼區均存在多態性的變化，這些多態性可能與哮喘、過敏性鼻炎和類風濕性關節炎(RA)等疾病的易感性相關[4-7]。Tim家族基因是否參與SLE的發生、發展目前少有報道。云南地處高原、紫外線輻射較強，為SLE高發地區，因此，筆者對云南高原地區漢族人群Tim-3啟動子區多態性位點-1516G>T的多態性與SLE以及與SLE相關自身抗體的關聯進行研究，為探索SLE易感的遺傳因素提供數據支持，為揭示SLE發病機制提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年10月至2013年10月在本院風濕免疫科就診的SLE患者132例，其中男16例，女116例；年齡18～58歲；SLE患者符合2009年美國風濕病協會修訂的SLE分類診斷標準。對照組為120例云南地區健康體檢者，其中男27例，女93例；年齡22～67歲，無自身免疫性疾病相關病史。所有對象均為三代以內居住在云南本地漢族居民，所有對象均無血緣關系。

1.2 儀器與試劑 PCR擴增儀(DA7600，China)；電泳儀(Bio-rad，USA)；凝膠成像系統(Bio-rad，USA)；熒光顯微鏡(Leica，Germany)；測序儀(ABI3730，USA)。人全血基因DNA提取試劑盒(Axygen，USA)；TaqDNA聚合酶1 U(Omega，USA)；dNTPs(Omega，USA)；瓊脂糖(Biowest,Spain)；熒光染料(EB，USA)；熒光免疫印跡試劑盒(Omon，Germany)；測序試劑盒(ABI，USA)。

1.3 方法

1.3.1 自身抗體檢測 在知情同意的原則下，采集SLE患者及健康體檢者乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血2 mL。SLE組及對照組均采用熒光免疫印跡試劑盒(Omon，Germany)檢測三種自身抗體：雙鏈DNA抗體(dsDNA)、Sm抗體、核糖核蛋白(RNP)抗體。

1.3.2 模板DNA提取 采用人全血基因DNA提取試劑盒(Axygen，USA)提取SLE患者及健康體檢者外周血基因組DNA，方法嚴格按照試劑盒說明書進行，提取產物溶于TE緩沖液，-20 ℃保存。

1.3.3 PCR反應 參照GenBank中Tim-3 DNA序列(編號AC023133)，利用Primer Premier 5.0軟件自行設計合成一對引物，P1：5′-GCC TTG ACC AAG TTC ATG CT-3′和P2：5′-ACC ACC CCG GAT AAT TTT GT-3′，PCR反應體系總體積25 μL：包括基因組DNA 100 ng，10×PCR緩沖液2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+、dNTPs各10 nmol，引物P1和P2各15 pmol，TaqDNA聚合酶1U(Omega，USA)，不足體積用滅菌雙蒸水補充至25 μL。PCR反應循環參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 酶切、瓊脂糖電泳 PCR產物用BslⅠ內切酶(Omega，USA)酶切：PCR產物5 μL，10×酶切緩沖液1 μL，限制性內切酶2 U，滅菌雙蒸水3.9 μL，混勻，55 ℃酶切3 h。酶切產物用2%瓊脂糖電泳、EB染色，觀察條帶。根據電泳圖確定基因型。

1.3.5 測序 選取部分代表不同基因型的擴增產物送上海生物工程公司測序，驗證電泳結果。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計分析，采用直接計數法計算基因型和等位基因頻率，進行Hardy-Weinberg平衡檢驗(P>0.05)，基因型和等位基因的組間比較、各自身抗體和基因型的相關性比較均采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Tim-3啟動子區-1516G>T位點多態性采用PCR-RFCP分析，PCR擴增產物長度為404 bp。酶切產物獲得3種基因型，即純合子GG基因型：有338、66 bp 2個片段；雜合子GT基因型：可見404、338和66 bp 3個片段；純合子TT基因型：僅有404 bp 1個片段，見圖1。

注：1為marker；2、4、6為GG基因型；3、5為GT基因型；7為TT基因型；8為PCR產物。

2.2 基因型測序分析圖 Tim-3基因啟動子-1516G>T位點GG、GT、TT 基因型測序分析圖，見圖2。

注：(a)GG基因型；(b)GT基因型；(c)TT基因型。

2.3 基因型與等位基因頻率分布 根據PCR產物酶切電泳結果，記錄各樣本的基因型，并采用直接計數法統計基因型，計算等位基因頻率。SLE組和對照組-1516G>T位點基因型頻數分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，達到遺傳平衡，具有群體代表性，見表1。χ2檢驗結果顯示，SLE組與對照組-1516G>T位點基因型和等位基因頻率分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 Tim-3基因-1516G/T位點基因型頻數分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.4 三種SLE相關自身抗體(雙鏈DNA抗體、Sm抗體、RNP抗體) 檢測結果表明，SLE組三種自身抗體檢測陽性率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。SLE組各基因型三種自身抗體檢測結果，見表4。經χ2檢驗，SLE組中雙鏈DNA抗體、Sm抗體、RNP抗體檢測陽性率與Tim-3基因啟動子-1516G>T位點基因分型均無相關性(P>0.05)，見表4。

表2 Tim-3基因-1516G/T位點基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

表3 2組三種自身抗體檢測陽性率比較(%)

表4 SLE組各基因型中三種自身抗體檢測結果[n(%)]

3 討 論

人類基因組單核苷酸多態性是基因組變異中最常見的一種形式，在人類基因組中大概每1 000個堿基就有1個SNP。不同人群之所以對疾病的易感程度有所區別、同種疾病的臨床表型不同以及對藥物會產生不同反應，部分受到SNP的影響。SNP作為第3代遺傳標記，在復雜疾病的基因定位、關聯分析、個體疾病易感性分析、同種疾病臨床表型分析以及藥物基因組學的研究中發揮著越來越重要的作用。許多研究均表明，Tim基因遺傳多態性與多種自身免疫性疾病和過敏性疾病的易感性、臨床表型有著密切的關系，且不同種族、不同地區之間由于遺傳特征不同導致多態性變異亦不同，但Tim基因多態性與SLE的關聯研究尚處于起步階段[8-10]。

本研究通過PCR-RFLP技術對132例SLE患者和120例健康人群Tim-3啟動子區多態性位點-1516G>T的多態性進行分析。SLE組與對照組-1516G>T基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，達到遺傳平衡，具有群體代表性。兩組間基因型及等位基因頻率比較，差異均有統計學意義，表明云南漢族人群Tim-3啟動子區多態性位點-1516G>T的多態性與SLE的遺傳易感性相關。

在SLE眾多相關自身抗體中，雙鏈DNA抗體、Sm抗體、RNP抗體三種抗體的檢測意義尤為明顯，其可能與疾病發病機制、疾病嚴重程度等密切相關[11]。本研究也發現，SLE組三種自身抗體檢測陽性率均高于對照組，差異有統計學意義。細胞因子基因編碼區的多態性可以通過抑制與特異性細胞因子受體的結合、啟動靶細胞或靶分子的信號轉導通路和二級信號通路，從而影響其編碼蛋白的結構和表達。相應地，這些變異也能夠影響自身免疫反應，導致自身免疫性疾病不同的病情嚴重程度以及自身抗體水平的差異，因此筆者分析了SLE三種自身抗體檢測陽性率與Tim-3基因啟動子區-1516G>T位點基因分型的關系，發現三種自身抗體檢測陽性率與Tim-3基因啟動子區-1516G>T位點基因分型均無明顯相關性，提示Tim-3基因-1516G>T位點不同基因型可能不會影響SLE相關自身抗體的表達，但其對Tim-3基因表達水平的影響及SLE疾病嚴重程度的影響尚有待于進一步研究證實。

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Association analysis of Tim-3 -1516G>T polymorphism with systemic lupus erythematosus in a han population of Yunnan Province*

GAOHui,PENGChuan-mei△,FUXiao-ye,CAOXiang-hong，DONGYu-lin，WANGYang

(DepartmentofMedicalLaboratory,TheAffiliatedYananHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanKunming650051,China)

Objective The aim of the present study was to analyze the association between the Tim-3 polymorphism -1516G>T and susceptibility to systemic lupus erythematosus(SLE) in a group of Han population from Yunnan province.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis(PCR-RFLP) was used to detect the polymorphism of -1516G>T site in 132 SLE patients and 120 controls.and we used indirect immunofluorescence assay and liner immunoblotting to detect three related aotuantibodies of SLE,which include the anti-double stranded DNA(dsDNA)antibody,the anti-Sm antibody and the anti-RNP antibody.We used direct counting method to calculate the genotype and allele frequencies to conduct the Hardy-Weinberg equilibrium test,and we used χ2test to compare the difference of the genotypic and allelic frequencies between SLE and control groups and the correlation of autoantibodies and genotypes.Results We found there are statistically significant differences in genotype and allele frequency of -1516G>T between SLE and control group(P<0.05);The genotype(GG,GT,TT)frequency in the SLE group is 0.818 2,0.181 8 and 0.000 0,which in the control group is 0.916 7,0.075 0 and 0.008 3 respectively.Conclusion The -1516 site of Tim-3 gene has SNP variations，the -1516G>T genotype maybe related with the susceptibility to SLE in a Han population of Yunnan province,but different genotypes may not affect the expression of related autoantibodies of SLE.

SLE； Tim-3； gene polymorphism； susceptibility

云南省科技廳-昆明醫科大學聯合專項項目(2011FB232)。

高輝，女，主任醫師，碩士，主要從事臨床血液學檢驗和分子生物學檢驗方面的研究。△

，E-mail：meizimh@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.004

A

1672-9455(2015)08-1034-03

2014-11-05

2015-01-12)