骨肉瘤外周血Runx3基因啟動子甲基化檢測及臨床意義

劉 融，陳令斌，張 勇

(武漢市普仁醫院：1.骨二科；2.骨一科 430081)

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·臨床研究·

骨肉瘤外周血Runx3基因啟動子甲基化檢測及臨床意義

劉 融1，陳令斌2，張 勇1

(武漢市普仁醫院：1.骨二科；2.骨一科 430081)

目的 研究骨肉瘤患者外周血Runt相關轉錄因子3(Runx3)基因啟動子甲基化及臨床意義。方法 選擇骨肉瘤患者及健康人作為研究對象，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)檢測兩組研究對象外周血Runx3基因啟動子甲基化并比較其差異，分析骨肉瘤患者Runx3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系。結果 骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子甲基化率(57.1%)顯著高于健康人(2.0%)，差異有統計學意義(P<0.05)。在不同性別、年齡、腫瘤部位和病理類型的骨肉瘤患者之間，外周血Runx3基因啟動子甲基化率的差異無統計學意義(P>0.05)，在不同KPS評分、腫瘤最大徑、病理性骨折、組織學分級和Enneking分期的骨肉瘤患者之間，差異均有統計學意義(P<0.05)。KPS評分低于70分、腫瘤最大徑大于或等于10 cm、有病理性骨折、組織學分級G3+G4及Enneking分期晚的骨肉瘤患者，其Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于KPS評分大于或等于70分、腫瘤最大徑小于10 cm、無病理性骨折、組織學分級G1+G2及Enneking分期早的骨肉瘤患者。結論 骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子呈高甲基化狀態，與KPS評分、腫瘤最大徑、病理性骨折、組織學分級和Enneking分期密切相關，可用于評估骨肉瘤患者病情及預后。

骨肉瘤； Runx3； 啟動子； 甲基化； 臨床意義

骨肉瘤的發病機制尚未完全明確，可能與環境及遺傳因素密切相關，遺傳因素包括基因突變及表觀遺傳學改變，其中甲基化異常是表觀遺傳學最常見的病因，越來越多的基因甲基化被發現參與骨肉瘤的發生和發展[1-2]。Runt相關轉錄因子3(Runx3)為新近發現的抑癌基因，其甲基化表達失活與胃癌等腫瘤的發病機制緊密相關[3]，但在骨肉瘤中報道較少。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)檢測骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子甲基化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014年6月診治的骨肉瘤患者為研究對象，納入標準：(1)初次就診，既往未行手術、放療或化療等治療；(2)均經X射線、CT、磁共振成像(MRI)和病理組織學檢查確診；(3)排除合并其他腫瘤及多發患者。本組骨肉瘤患者共納入70例，包括男43例，女27例；平均(24.1±5.8)歲。另選擇門診行健康體檢的健康者50例為對照，其中男30例，女20例；平均(24.5±6.1)歲。兩組研究對象在性別組成和年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 Runx3基因啟動子甲基化檢測 骨肉瘤患者和健康者空腹8 h后取靜脈血檢測Runx3基因啟動子甲基化，檢測方法為MS-PCR。采用MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設計MS-PCR引物，見表1，反應體系為25 μL，循環條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性1 min，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個循環后最后一輪72 ℃延伸10 min。MS-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

表1 Runx3基因啟動子甲基化MS-PCR檢測引物序列

1.3 統計學處理 采用SigmaPlot12.0進行統計學分析。不同臨床病理因素中Runx3基因啟動子甲基化率的差異采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Runx3基因啟動子甲基化對比 70例骨肉瘤患者中有40例外周血基因啟動子檢測到甲基化，Runx3基因啟動子甲基化率為57.1%；50例健康者中有1例外周血基因啟動子檢測到甲基化，Runx3基因啟動子甲基化率為2.0%，骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于健康者(χ2=37.016，P<0.05)。

2.2 Runx3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系 在不同性別、年齡、腫瘤部位和病理類型的骨肉瘤患者之間，外周血Runx3基因啟動子甲基化率的差異無統計學意義(P>0.05)，在不同KPS評分、腫瘤最大徑、病理性骨折、組織學分級和Enneking分期的骨肉瘤患者之間，差異均有統計學意義(P<0.05)。KPS評分低于70分、腫瘤最大徑大于或等于10 cm、有病理性骨折、組織學分級G3+G4及Enneking分期晚的骨肉瘤患者Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于KPS評分大于或等于70分、腫瘤最大徑小于10 cm、無病理性骨折、組織學分級G1+G2及Enneking分期早的骨肉瘤患者，見表2。

表2 不同臨床病理因素骨肉瘤患者中Runx3基因啟動子甲基化率比較(n)

續表2 不同臨床病理因素骨肉瘤患者中Runx3基因啟動子甲基化率比較(n)

3 討 論

骨肉瘤的發病機制尚未完全明確，主要與基因突變及表觀遺傳學等遺傳因素有關，表觀遺傳學因素主要包括甲基化，越來越多的基因甲基化表達沉默被證實參與了腫瘤的發生和發展[4]。甲基化不依賴于DNA堿基突變，自身結構或結合甲基結合蛋白可調控基因表達，為基因轉錄前調控最常見的作用機制[5]，在越來越多的腫瘤中檢測到甲基化改變，在腫瘤的早期診斷、病情及預后評估中扮演重要角色[6]。Runx3基因是新近發現的抑癌基因，主要通過調控TGF-β信號傳導通路而發揮調控細胞周期的功能，其表達水平下降導致正常細胞失去調控而發生癌變，在越來越多的腫瘤中可檢測到Runx3基因的甲基化表達失活狀態[7]。研究表明，與Runx3基因同家族的Runx2基因在骨肉瘤組織中mRNA表達低于健康人[8]，進一步研究發現其處于高甲基化沉默狀態，基于Runx3基因與Runx2基因功能類似，推測Runx3基因啟動子甲基化可能與骨肉瘤的發病機制密切相關。本研究中骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子甲基化率(57.1%)顯著高于健康者(2.0%)，差異有統計學意義(P<0.05)，證實了Runx3基因啟動子甲基化與骨肉瘤發病機制的相關性。

在消化系統和生殖系統腫瘤中可檢測到Runx3基因的高甲基化狀態，進一步發現其甲基化水平與臨床病理因素相關，可作為其診斷、病情及預后評估的標志物，較蛋白質標志物具有更高的靈敏度及特異性[9]，基于這些證據，推測Runx3基因啟動子甲基化可能與骨肉瘤的病情及預后密切相關。在不同性別、年齡、腫瘤部位和病理類型的骨肉瘤患者之間，外周血Runx3基因啟動子甲基化率的差異無統計學意義(P>0.05)；在不同KPS評分、腫瘤最大徑、病理性骨折、組織學分級和Enneking分期的骨肉瘤患者之間，差異均有統計學意義(P<0.05)。KPS評分低于70分、腫瘤最大徑大于或等于10 cm、有病理性骨折、組織學分級G3+G4及Enneking分期晚的骨肉瘤患者Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于KPS評分大于或等于70分、腫瘤最大徑小于10 cm、無病理性骨折、組織學分級G1+G2及Enneking分期早的骨肉瘤患者。這些證據表明，Runx3基因啟動子甲基化與其他腫瘤類似，在骨肉瘤的病情及預后評估中扮演重要角色。本研究僅檢測骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子甲基化，推測骨肉瘤組織中可能存在Runx3基因啟動子甲基化狀態，與手術切除標本對比，外周血標本可能更具有前瞻性的優點，在臨床應用中更具有價值。

吳同申等[9]采用流式細胞儀檢測了骨肉瘤中Runx3蛋白質的表達水平，發現Runx3在骨肉瘤中的表達水平明顯低于良性腫瘤，骨肉瘤中Runx3表達水平在不同軟組織浸潤及不同Ennecking分期的比較中有顯著差異，說明Runx3蛋白質檢測對判斷預后有一定價值。進一步研究發現，除Hs888T細胞系的Runx3基因的啟動子區域CpG島可發生廣泛甲基化外，MG63、G292、Hs919T、saos2、Hs860T、Hs707A、HOS等細胞系的Runx3啟動子區域CpG島僅發生部分甲基化[10]；實時熒光定量PCR顯示，MG63、saos2、G292等骨肉瘤細胞系可見明顯的Runx3表達，Hs919T、Hs707A、HOS等骨肉瘤細胞系也有不同程度的Runx3表達，實驗結果表明在骨肉瘤細胞系中未見明顯的Runx3表達異常，在Runx3啟動子區域CpG島沒有發生廣泛甲基化等表觀遺傳學異常改變，但本研究中骨肉瘤患者外周血Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于健康者，證實了Runx3基因啟動子甲基化與骨肉瘤發病機制的相關性，與前述研究結論相反，可能與細胞和人體表達不一致有關，有待于進一步研究證實。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.07.044

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1672-9455(2015)07-0978-02

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2014-11-22)