實時熒光定量PCR檢測宮腔脫落細胞中P27kip1及cylin E基因的表達及意義

李菊香，潘云燕，曹 玲，文惠方，葛萬文，楊佩琦，沈明輝，張尚弟，常運朝，胡 巍，車團結,△

(1.蘭州大學第二醫院，蘭州 730000；2.甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，蘭州 730000；3.甘肅省基因芯片公共服務平臺，蘭州 730000)

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·論 著·

實時熒光定量PCR檢測宮腔脫落細胞中P27kip1及cylin E基因的表達及意義

李菊香1，潘云燕1，曹 玲1，文惠方1，葛萬文1，楊佩琦1，沈明輝1，張尚弟1，常運朝2，胡 巍3，車團結2,3△

(1.蘭州大學第二醫院，蘭州 730000；2.甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，蘭州 730000；3.甘肅省基因芯片公共服務平臺，蘭州 730000)

目的 探討宮腔脫落細胞中P27kip1、cyclin E基因的表達在子宮內膜癌早期診斷中的意義。方法 收集健康志愿者及子宮內膜癌患者宮腔脫落細胞樣本共80例；提取總RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測目的基因的表達，比較健康志愿者及子宮內膜癌患者宮腔脫落細胞中P27kip1、cyclin E基因表達量的差異。結果 熒光定量PCR結果顯示，P27kip1基因在健康志愿者宮腔脫落細胞中的表達顯著高于子宮內膜癌患者，差異有統計學意義(P<0.05)，并隨惡性程度升高，P27kip1的表達水平降低，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)；cyclin E基因的表達隨惡性程度的增高而增高，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 聯合檢測P27kip1和cyclin E基因可作為子宮內膜癌早期診斷的依據。

實時熒光定量PCR； 子宮內膜癌； P27kip1； cyclin E； 早期診斷

子宮內膜癌(EMC)占女性生殖系統惡性腫瘤的20%～30%，近年來其發病率及發病年齡呈上升和年輕化趨勢[1-2]。目前醫院對EMC的診斷普遍采用診刮術配以病理學檢查的方法，檢出率和準確性較低[3]。同時，診刮術給患者帶來極大痛苦，因此開發更簡便易行、無痛、價廉、準確性高、能對高危患者進行初篩的檢查方法顯得尤為迫切。隨著分子生物學的迅猛發展，基因檢測可能將成為子宮內膜癌早期診斷，篩查高危人群的主要手段[4]。報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 采用內膜吸管收集2006～2011年蘭州大學第二醫院婦產科、甘肅省人民醫院婦產科原發性子宮內膜癌患者宮腔脫落細胞樣本共60例(患者組)，年齡38～70歲，平均年齡(54.5±15.6)歲，所有患者術前均未做放療、化療及免疫治療。根據FIGO 2009年子宮內膜癌分期標準，Ⅰ期33例，Ⅱ期22例，Ⅲ期以上15例，所有病例臨床資料完整。同時收集健康志愿者宮腔脫落細胞樣本20例作為健康對照組，2組研究對象的年齡、絕經狀態等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 檢測方法 根據PubMed公布的P27kip1、cyclin E 的cDNA序列設計特異性引物，以β-actin為內參照；Trizol法提取所有研究對象的樣本總RNA，將其逆轉錄為cDNA，全部cDNA濃度均調整為10 ng/μL，進行PCR反應之前，所有cDNA樣本、引物濃度等均標準化；將制備好的cDNA(10 ng/μL)各取1 μL在ABI Prism 7300 Real-time PCR儀上進行實時 PCR 反應，PCR循環參數：95 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，40 個循環，目的基因的擴增效率和管家基因的擴增效率一致，實驗結果應用ΔΔCt方法進行相對定量[5]。見表1。

表1 引物序列表

1.3 儀器與試劑 電子分析天平(日本島津株式會社)，低溫冷凍超速離心機(德國GAMR)，System 9700 PCR儀(美國ABI)，穩壓電泳系統(北京六一廠)，電熱恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)，凝膠成像系統(美國ABI)，MDF1-290超低溫冰箱(日本三洋)，ABI Prism 7300 Real-time PCR儀(美國 ABI)。Trizol試劑，逆轉錄酶，Oligd(T15)引物，引物合成，熒光定量檢測試劑盒，瓊脂糖均購自 TaKaRa公司；其余試劑均為國產產品。

2 結 果

2.1 2組研究對象宮腔脫落細胞中P27kip1的表達 實時熒光定量PCR法檢測結果顯示，2組P27kip1基因的表達量有一定變化趨勢(2-ΔΔCt<1表示表達量較健康對照組降低，2-ΔΔCt>1表示表達量較健康對照組升高)，健康對照組與患者組各期患者比較，其表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，與Ⅲ期以上比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期以上各組P27kip1表達量依次下降，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示P27kip1基因的表達量在健康者及子宮內膜癌患者宮腔脫落細胞中的表達量存在差異，隨惡性程度增高，P27kip1表達量降低。見表2。

表2 所有研究對象P27kip1在宮腔脫落細胞中的表達結果比較

2.2 2組研究對象宮腔脫落細胞中cyclin E的表達 實時熒光定量PCR結果顯示(2-ΔΔCt<1表示表達量較健康對照組降低，2-ΔΔCt>1表示表達量較健康對照組升高)，健康對照組與患者組各期比較，差異有統計學意義(P<0.05)，與Ⅲ期以上比較差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期以上各組組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，提示cyclin E基因的表達量在子宮內膜癌及健康者的表達量存在明顯差異，呈一定的變化規律，隨著惡性程度增高，其表達量也升高，且與P27kip1的表達呈負相關。見表3和圖1。

表3 所有研究對象cyclin E在宮腔脫落細胞中的表達結果比較

圖1 P27kip1及cyclin E在宮腔脫落細胞中表達量的變化趨勢

2.3 P27kip1及cyclin E基因與子宮內膜癌的相關性分析 P27kip1及cyclin E基因與子宮內膜癌的發生、發展密切相關，兩者在子宮內膜癌患者宮腔脫落細胞中發生異常表達，且隨著惡性程度的升高，兩基因的表達呈現一定的變化規律，P27kip1低表達而cyclin E高表達，提示P27kip1和cyclin E基因可作為子宮內膜癌早期診斷的標志物。

3 討 論

EMC是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，隨著近些年人類生活環境的改變，子宮內膜癌的發病率呈現逐年上升趨勢及年輕化趨勢[1]。Loukovaara等[2]對美國女性子宮內膜癌的發病及病死率進行統計，發現2009年全美新增子宮內膜癌病例42 160例，病死7 780例，在女性生殖道惡性腫瘤中發病率第一。目前，臨床對子宮內膜的診斷及確診常采用宮腔鏡檢查、診斷性刮宮等方法，此類方法在不同程度上給患者生理及心理造成了極大的傷害和痛苦，且此類方法的診斷結果有80%患者都為良性，這與臨床實際情況不符[3]。而宮腔脫落細胞樣本收集方法簡單，無痛，因此本研究收集健康志愿者及患者宮腔脫落細胞樣本，通過熒光定量PCR技術檢測脫落細胞中腫瘤相關標志物的表達變化情況，達到對子宮內膜癌的早期診斷。

有研究表明，EMC的發生同其他腫瘤的發生、發展一樣，均由多種基因共同參與和協同作用，同樣與抑癌基因失活或突變、原癌基因激活等有關[6]。本研究結果顯示，利用熒光定量PCR法檢測宮腔脫落細胞中 P27kip1及 cyclinE 基因表達變化規律與文獻報道的利用子宮內膜癌組織為樣本的檢測結果相一致[7]。提示宮腔脫落細胞樣本可作為檢測樣本對子宮內膜癌進行廣譜型篩查，同時為子宮內膜癌甚至是其他癌癥的早期診斷供了一種新的思路和檢測方法。

相關研究報道，P27kip1基因是調控細胞周期并抑制細胞分裂的重要基因，是目前細胞分子生物學、腫瘤分子生物學等學科的研究熱點，P27kipl蛋白具有高度同源性的熱穩定蛋白質，對腫瘤的發生、發展及預后作用國外已有眾多報道,如結直腸癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等[8-11]。Hewedi等[12]的研究發現細胞分化程度越低，惡性程度越高，P27kip1陽性表達率越低，提示P27kip1的異常表達與子宮內膜癌的分化程度有密切關系。本研究結果表明，健康對照組，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期以上患者組宮腔脫落細胞中P27kip1蛋白的表達量呈現出一定的變化趨勢，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期以上患者組與健康對照組比較，表達量依次顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Ⅲ期以上患者組與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期以上患者組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)；由此可見P27kip1的表達量在各組宮腔脫落細胞中的表達量呈一定的變化趨勢，隨著惡性程度增高，其表達量降低，這一結果與有關文獻報道一致[13]。提示檢測宮腔脫落細胞中P27kip1基因的表達對子宮內膜癌的早期診斷具有一定的指導意義。

細胞周期素E(cyclin E)是細胞G1期分泌的蛋白，與細胞周期素依賴性激酶(CDK)-2在G1期末結合而發揮作用,促進細胞進入S期，但是如果其過度表達可導致細胞增殖失控，是腫瘤發生、發展的內在原因之一[14]。Guthalu等[15]的研究顯示，cyclin E與腫瘤的發生、發展關系密切。本研究結果提示，各組宮腔脫落細胞中，cyclin E的基因表達健康對照組與患者組各期比較，差異有統計學意義(P<0.05)，與患者組Ⅲ期以上比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期以上cyclin E的表達量依次呈上升趨勢，患者組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著惡性程度增高，cyclin E表達升高，結果與P27kip1的檢測結果呈負相關，這是因為在正常細胞中P27kip1是CDK抑制因子之一，其參與細胞的增殖和分化調控，并能抑制cyclin E 與CDK2分子結合，阻止細胞由G1 期進入S 期，從而抑制細胞的增殖[16]。當P27kip1的表達失活或異常時，由P27kip1參與的細胞增殖和分化調控失控，同時cyclin E表達升高，細胞向癌變發展[17]。

本研究結果表明，P27kip1與cyclin E基因是癌癥發生、發展整個復雜過程中其中2個比較關鍵的因子，兩者在子宮內膜癌的發生、發展及惡性化過程中，其表達量存在微妙的變化規律，隨著惡性程度升高，P27kip1的表達量降低而cyclinE基因表達量升高，兩者的表達變化呈負相關。所以同時檢測宮腔脫落細胞中P27kip1及cyclinE基因的表達量變化對子宮內膜癌的早期診斷具有臨床意義，同時也為子宮內膜癌或其他癌癥的診斷提供了一定的思路和方法。

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Real-time quantitative PCR in determination of P27kip1and cyclin E expression in ntrauterine exfoliated cells and its clinical relevance*

LIJu-xiang1,PANYun-yan1,CAOLing1,WENHui-fang1,GEWan-wen1，YANGPei-qi1,SHENMing-hui1,ZHANGShang-di1,CHANGYun-chao2,HUWei3,CHETuan-jie2，3△

(1.LanzhouUniversitySecondHospital,Lanzhou,Gansu730000,China;2.KeyLaboratoryofFunctionalGenomicsandMolecularDiagnosis,Lanzhou,Gansu730000,China;3.GeneChipPublicServicePlatforminGansuProvince,Lanzhou,Gansu730000,China)

Objective To dectect the expression of P27kip1and cyclin E genes in intrauterine exfoliated cells of endometrial cancer and normal people and explore its clinical relevance in diagnosing and prognostic monitoring.Methods 80 cases about intrauterine exfoliated cells of the endometrial cancer patients and normal people were collected and extracted the total RNA.And the target genes were detected by the real-time quantitative PCR and calculate the data through the method of ΔΔCt.Then compare the expression of P27kip1and cyclin E genes in endometrial cancer patient and normal people.All the experimental data were statistically analyzed by SPSS17.0 software.Results The real-time quantitative PCR dedicated that the expression of P27kip1gene in normal people was higher than endometrial cancer patients(P<0.05).With the increasing degree of malignancy,the expression of P27kip1was significantly reduced(P<0.05).The expression of cyclin E gene was presented a negative correlation with P27kip1.Conclusion Real-time fluorescent quantitative PCR can sensitively and specifically detected the expression of P27kip1and cyclin E in the intrauterine exfoliate cells.There has a close relationship between the expression of P27kip1and cyclin E and the development of endometrial cancer.The research has provide us some theory and data support of the diagnosing and monitoring of endometrial cancer.

real-time quantitative PCR; endometrial cancer; P27kip1gene; cyclin E gene; early diagnosis

甘肅省科學計劃項目(113JHTA003)； 蘭州市科學計劃項目(2010-1-143)。

李菊香，女，本科，副主任護師，主要從事婦產科宮頸癌篩查、母嬰保健、優生優育、母嬰健康教育及管理研究。△

，E-mail:chetj@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.009

A

1672-9455(2015)12-1681-03

2015-01-22

2015-03-24)