子癇前期患者血清微小RNAs的差異表達研究

厲 倩,龍安雄,姜連生,蔡雷鳴,謝 驪,顧繼安,譚龍益

(上海市第一人民醫院寶山分院檢驗科 200940)

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·論 著·

子癇前期患者血清微小RNAs的差異表達研究

厲 倩,龍安雄,姜連生,蔡雷鳴,謝 驪,顧繼安,譚龍益△

(上海市第一人民醫院寶山分院檢驗科 200940)

目的 探討子癇前期患者血清微小RNAs(miRNAs)不同的表達水平，分析子癇前期相關標志物。方法 選擇10個子癇前期患者胎盤中差異表達的miRNA，分別收集該院30例子癇前期患者和30例正常妊娠孕婦孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血清miRNAs，采用SYBR Green qRT-PCR法檢測血清中10個miRNAs的表達量。結果 子癇前期胎盤中高表達的3個miRNAs(miR-152、miR-183、miR-210)在子癇前期孕中、晚期血清中表達顯著升高，而胎盤中高表達的miR-182僅在子癇前期孕晚期表達顯著升高；子癇前期胎盤中低表達的6個miRNAs(miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584)在子癇前期各個孕期的表達，差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 miR-152、miR-183、miR-210在子癇前期孕中、晚期血清中表達顯著升高，可能是預測子癇前期發生的良好生物標志物。

子癇前期； miRNAs； 血清; 生物標志物

子癇前期(PE)是一種常見的孕婦多系統紊亂綜合征，是孕婦和胎兒發病率(5%)和病死率最高的疾病之一，全球每年大約800萬人受到影響，7萬孕婦病死[1]。其主要表現為在懷孕20周后出現高血壓和蛋白尿，部分患者出現水腫、頭痛，嚴重者發生子癇、肝腎功能和凝血障礙，成人呼吸窘迫綜合征和胎兒發育障礙等，發生過子癇的孕婦其后患高血壓、心血管疾病的風險概率也增加。胎兒分娩和胎盤剝離是目前唯一的治療手段，但早期對高危孕婦進行干預，可減少子癇的發生及減輕危害，具有一定的臨床價值。

子癇前期的病因和病理學機制尚不清楚，且缺乏較理想的早期診斷指標[2]。有研究報道在子癇前期胎盤中發現了異常表達的微小RNAs(miRNAs，miRNAs)，這為該研究開辟了一個新方向[3]。目前的相關研究表明miRNAs與子癇前期的發生密切相關，已發現多個與子癇前期有關的差異表達miRNAs，但多數都是在胎盤中進行檢測[3-5]。現通過檢測子癇前期患者不同孕周外周血miRNAs，分析某變化規律，探討miRNAs作為子癇前期預測因子的臨床價值。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2013年12月該院分娩的30例PE患者(病例組)和30例正常妊娠產婦(對照組)。PE診斷標準依據婦產科學(第7版)[3]，即妊娠20周后收縮壓大于或等于140 mm Hg和(或)舒張壓大于或等于90 mm Hg，伴蛋白尿大于或等于0.3 g/24 h，或隨機蛋白尿陽性。所有研究對象都是單胎妊娠，對照組和病例組的年齡、孕前體質量指數(BMI)等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。收集對照組孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血清30例，收集病例組孕早期血清14例、孕中期30例、孕晚期30例。見表1。

表1 2組研究對象臨床資料結果比較

1.2 樣本采集、處理及保存 采用分離膠真空采血管采集空腹血樣3～5 mL，靜置20 min后離心，1 200 r/min，離心10 min。首次離心后收集上清液并高速(12 000 r/min)離心10 min，置上清液于無RNA酶的無菌Eppendorf管中，-80 ℃凍存備用。

1.3 RNA抽提 使用miRNeasy Serum/Plasma kit(德國Qiagen公司)提取血清總RNA，嚴格按照說明書進行操作：200 μL血清加入1 mL Qiazol溶解液，充分混勻，室溫放置5 min，加入3.5 μL的Cel miR-39(1.6～108/μL,Qiagen)作為RNA抽提質量指標，然后加入200 μL的氯仿，充分混勻，室溫放置3 min,后置于低溫離心機(美國Sigma公司)內12 000 r/min離心15 min，將550 μL上層澄清萃取液轉移到新的1.5 mL無菌Eppendorf管中，加入1.5倍(825 μL)的無水乙醇，充分混勻，分2次將混合液過洗脫柱，棄去濾過液，洗脫柱分別用700 μL RWT、RPE緩沖液和80%乙醇溶液洗滌，末次洗滌后洗脫柱高速(12 000 r/min)離心5 min以干燥柱內膜，最后加入14 μL無RNA酶水洗脫總RNA。

1.4 cDNA第1鏈合成 應用miScript Ⅱ逆轉錄試劑盒(德國Qiagen)合成cDNA第1鏈(加尾法)，操作步驟：150 μL PCR反應管中加入2 μL 10×RT mix，2 μL 10×nucleics mix，8 μL無RNA酶水，4 μL 5×hispec Buffer和4 μL總RNA，充分混勻并低速(1 200 r/min)離心1 min后置于擴增儀(Bioer)中，36 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。

1.5 熒光定量PCR 采用miScirpt SYBR green PCR 試劑盒(德國Qiagen公司)和ABI 7500擴增儀(美國ABI公司)進行熒光實時定量。反應體系：10 μL 2×master mix，2 μL 10×通用引物，2 μL 10×特異性引物，4 μL 無RNA酶水和2 μL 100倍稀釋的cDNA模板。擴增條件：95 ℃變性15 min，循環條件94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 34 s，延伸階段采集熒光信號，共40個循環。內參基因為血清中穩定存在的miR-16。目標miRNA，miR-16和Cel miR-39分別在不同的反應孔中進行擴增。所有熒光定量PCR反應在96孔反應板內進行。使用SDS1.3(Applied Biosystems)軟件分析Ct值，每個標本都做3個平行復孔，取Ct平均值。將目標miRNAs的平均Ct值減去內參miR-16 Ct值作為ΔCt值，ΔCt值越低，則表達水平越高，計算標準化后的2-ΔΔCt值表示miRNA的組間表達倍數變化。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間兩兩比較使用Student′st檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 外周血清 miRNAs的檢測結果比較 各組血清中均能檢測到Cel miR-39、miR-16及 10種目標miRNAs，其中Cel miR-39在各組中的含量非常穩定，說明實驗中的RNA抽提、逆轉錄和擴增條件控制較好，miR-16在各組的表達量穩定，表明miR-16可作為內參基因。見表2。

2.2 血清中10種miRNAs在不同孕期的表達量比較 與正常妊娠同孕期比較，PE患者孕早期(12～14周)血清中10種miRNAs的表達量，差異無統計學意義(P>0.05)，PE患者孕中期(20～24周)miR-152、miR-183、miR-210的表達量升高，PE患者孕晚期(28～32周)miR-152、miR-182、miR-183、miR-210的表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 血清中12種miRNAs的檢測結果比較

表3 血清中10種miRNAs的表達量結果比較

2.3 PE患者妊娠中、晚期miR-152、miR-182、miR-183、miR-210與正常妊娠表達倍數變化 miR-152、miR-183、miR-210在妊娠中期PE患者血清中的表達分別為正常妊娠的5.28、12.99、11.1倍，而miR-182在妊娠晚期PE患者血清中的表達為正常妊娠的3.73倍。見表4。

表4 2組研究對象表達升高的miRNAs的倍數值 (相對倍數變化，2-ΔΔCt)

3 討 論

miRNAs是一類全長為19～25個核糖核苷酸的非編碼調控單鏈小分子RNA,由一段具有發卡環結構的單鏈RNA前體剪切后生成,通過與目標mRNA分子的3′端非編碼區域(3′UTR)互補配對使目標mRNA分子的翻譯受到抑制，從而在轉錄后對靶基因的表達水平進行調控[6]。生物信息分析顯示，只占人類基因組1%～3%的miRNA調控著高達30%的人類基因。近年來的研究表明miRNA在細胞增殖、分化、凋亡，腫瘤形成，心血管疾病等生理和病理過程中都起非常重要的作用。

miRNAs不僅存在于組織細胞中，在血漿或血清中也非常穩定，這為miRNAs進行臨床疾病研究提供了依據[7]。Gilad等[7]發現采用qRT-PCR技術可對人體的尿液、唾液、羊水及胸水miRNAs進行定量，這些體液中的miRNAs表達異常可能預示機體功能的改變。已有多項研究顯示血清miRNAs表達譜與多種腫瘤相關，可能在腫瘤的診斷及預后判斷方面具有重要價值。

目前多數文獻報道PE胎盤中異常表達的miRNAs，有關血清miRNAs表達譜與子癇前期的關系尚未明確。本組通過分析2001～2011年PubMed數據庫文獻，確定10個在2個或2個以上研究中均表明在胎盤組織中表達上調或下調的miRNAs，其中表達上調的是miR-210、miR-182、miR-183、miR-152，表達下調的是miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584，使用SYBR Green qRT-PCR技術檢測PE患者不同孕期血清中10個miRNAs的表達水平。

與胎盤中的miRNAs研究結果相一致[3-5]。PE患者孕晚期血清中miR-210、miR-182、miR-183、miR-152的表達均高于正常妊娠者，其中miR-210、miR-183、miR-152在孕中期即已經高于正常妊娠者，提示孕中期miR-210、miR-182、miR-152可作為PE的風險預測因子。PE患者血清中miR-210表達升高已有報道[8]。而miR-182、miR-183、miR-152在PE患者血清中表達升高尚未見相關報道。胎盤中升高的miRNAs可能通過外排體(exosome)的形式分泌到血液中，進而影響到血清、血漿miRNA表達譜。

與正常妊娠者比較，miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584在胎盤研究中表達下調的miRNAs，在PE患者血清中的表達,差異無統計學意義(P>0.05)，這可能是受到了其他目前未知的干擾因素影響，因為這些miRNAs不是胎盤的特異性，其他組織、細胞也可能分泌。Yang 等[9]應用下一代測序技術比較了2例PE重度、2例PE輕度和1例正常妊娠孕婦在分娩前血清miRNAs表達譜，結果只發現3個與其他胎盤miRNAs表達譜研究報道一致的結果，這可能是因為血清受到其他更多干擾因素的影響，胎盤與血清中的結果并不總是正相關。胎盤特異性miRNAs由于只在胎盤組織表達，其在胎盤組織和外周血中的相關性可能會更好，這可能是未來外周血PE相關miRNAs的研究熱點[10-11]。

綜上所述，本研究結果表明，PE患者孕中期miR-210、miR-183、miR-152表達升高，并維持至孕晚期，miR-182在PE孕晚期表達升高，提示miR-210、miR-183、miR-152可能是預測子癇前期發生的良好生物標志物。

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Study on the differential expression of microRNAs in the preeclampsia serum*

LIQian,LONGAn-xiong,JIANGLian-sheng,CAILei-ming,XIELi,GUJi′an,TANLong-yi△

(DepartmentofClinicalLaboratory,BaoshanBranchofShanghaiFirstPeople′sHospital,Shanghai200940,China)

Objective To study the differential expression of serum microRNAs in preeclampsia(PE) patients so as to find some serum biomarkers related to PE.Methods Ten microRNAs were selected according to their reported differential expression in PE placenta.30 PE patients and 30 normal pregnacy were recruited in the study.The expression of these 10 microRNAs in serum from the differnt trimesters were determined by SYBR Green quantitive reverse transcription-PCR(qRT-PCR).Results Compared with control,the expression of miR-152,miR-183,miR-210 were higher in both second and third trimester,the expression of miR-182 was only higher in third trimester.While the expression of 6 miRNAs were downregulated in PE plancenta,namely miR-1,miR-328,miR-363,miR-377,miR-500,miR-584,showed no significant difference between PE patients and normal pregnacy throughout the three trimesters.Conclusion The expression of serum miR-152,miR-183,miR-210 elevated since the second trimester,indicating their potential role as serum biomarkers for forcasting PE.

preeclampsia； microRNA； serum； biomarker

上海市寶山區科委科研項目(11-E-15)。

厲倩，女，碩士，主管技師，主要從事妊娠相關疾病的實驗室診斷研究。△

，E-mail:sybspyl163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.013

A

1672-9455(2015)12-1692-03

2014-12-22

2015-02-18)