賴氨大黃酸通過調控miRNA表達水平抑制HBV增殖*

張榮花，王密斯，王 琳，馮雪研，郝曉方，甄永占，李 琳，陳 靜，章廣玲,2△

(1.華北理工大學基礎醫學院病原生物學與免疫學教研室，河北唐山 063000；2.河北省唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室 063000)

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·論 著·

賴氨大黃酸通過調控miRNA表達水平抑制HBV增殖*

張榮花1，王密斯1，王 琳1，馮雪研1，郝曉方1，甄永占1，李 琳1，陳 靜1，章廣玲1,2△

(1.華北理工大學基礎醫學院病原生物學與免疫學教研室，河北唐山 063000；2.河北省唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室 063000)

目的 研究賴氨大黃酸在體外對乙型肝炎病毒(HBV)增殖及病毒抗原表達的影響及分子機制，為研究賴氨大黃酸抗HBV作用機制奠定初步的實驗依據。方法 將HepG2.2.15細胞分為實驗組(分別加入5、10、20、40、80 μmol/L賴氨大黃酸)及不加賴氨大黃酸的對照組，分別培養24、48 h收獲上清液，采用四唑氮化合物(MTS)法檢測細胞的增殖活性，采用ELISA法檢測HBsAg和HBeAg的表達水平，實時定量PCR(RT-PCT)檢測其中HBV DNA的拷貝數及miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217的表達水平。miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217反義鏈(ASO)分別轉染HepG2.2.15細胞后，MTS法檢測細胞的增殖活性，ELISA法檢測HBsAg和HBeAg的表達水平。結果 在沒有對HepG2.2.15細胞的增殖活性產生影響的情況下，賴氨大黃酸抑制了HBsAg的產生和HBV的增殖。20 μmol/L的賴氨大黃酸明顯促進了miR-210、miR-185、miR-199a-3p的表達，而抑制了miR-370的表達，與對照組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論 賴氨大黃酸可能通過影響細胞內miRNA的表達抑制HepG2.2.15細胞中HBV的增殖和HBsAg的產生。

賴氨大黃酸； 乙型肝炎病毒； 乙型肝炎病毒表面抗原； miRNA

乙型肝炎病毒(HBV)是一種可引起人類急、慢性肝炎的DNA病毒。雖然有高活性的乙肝疫苗，而且已廣泛使用了20多年，但HBV的感染仍然是一個危害全球健康的重大疾病。全球有超過3.5億的HBV感染者，而且每年急慢性HBV感染致死人數約有一百萬。中藥對病毒性傳染病的作用是肯定的，大黃酸是傳統中藥大黃中的一個重要蒽醌類化合物，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗菌、抗病毒等。不同劑量的大黃酸具有不同的功效。由于大黃酸水溶性差，生物利用度低，其進一步應用受到很大限制。為了改善大黃酸的水溶性，對大黃酸進行結構改造獲得了水溶性好的賴氨大黃酸，與大黃酸相比，賴氨大黃酸溶解度顯著提高為8 mg/mL，其中的賴氨酸鹽是人體8種必需氨基酸之一，安全無不良反應[1]。本項目首次探討賴氨大黃酸體外對HBV復制的調控作用，確定賴氨大黃酸是否通過調控微小RNA(miRNA)的表達進而影響HBV的蛋白表達和病毒增殖，通過分析賴氨大黃酸與miRNA在HBV感染中的作用，為理解賴氨大黃酸、細胞miRNAs調控病毒增殖提供新的理論依據，也為今后開發抗病毒藥物或手段提供新的分子基礎或靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 四唑氮化合物(MTS)購自美國Sigma公司，ELISA速顯檢測試劑盒購自英科新創(廈門)科技有限公司。HepG2.2.15細胞由天津醫科大學生命科學中心實驗室提供。miRNA反義鏈(ASO)由美國Sigma公司合成。Trizol購自上海生工生物工程技術服務有限公司。專利藥賴氨大黃酸由衛生部北京醫院/衛生部北京老年醫學研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 HepG2.2.15細胞培養 HepG2.2.15細胞培養基為含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM-α，細胞于37 ℃ 5% CO2的細胞培養箱中生長。實驗組：賴氨大黃酸濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL。對照組：不加入賴氨大黃酸。細胞轉染：轉染前1 d，胰酶消化細胞并計數，8 000～11 000 cell/100 μL每孔鋪板。分別取miRNA ASO和LacZ基因，分別按Invitrogen公司Oligofectamine Reagent轉染試劑盒說明書配制轉染試劑/DNA混合液：按每孔0.3 μL Oligofectamine Reagent試劑、30 pmol ASO及90 μL無血清培養基Opti-MEM配制，混勻后加入96孔板中，置于37 ℃ 5% CO2孵箱中培養48 h。實驗在同等條件下重復3次。

1.2.2 MTS法檢測HepG2.2.15細胞增殖活性 將HepG2.2.15細胞8 000～11 000 cell/100 μL每孔接種于96孔培養板中，24 h貼壁后分別加入5、10、20、40、80 μmol/L濃度的賴氨大黃酸，每個濃度設9個復孔，分別培養24、48 h，吸出上清后，每孔加入培養液100 μL，每孔加MTS 20 μL(MTS:PMS比例為19∶1)，置于37 ℃ 5% CO2孵箱繼續培養2 h。取出培養板，采用μQuant分光光度計檢測波長為490和630 nm的各孔吸光度值(A490和A630)。以(實驗孔A490-空白孔A490)/(LacZ孔A490-空白孔A490)作為標準化后的數據，采用SPSS11.0軟件包對3個孔的均值進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

1.2.3 ELISA法檢測HBsAg和HBeAg 將HepG2.2.15細胞8 000～11 000 cell/100 μL每孔接種于96孔培養板中，24 h貼壁后分別加入5、10、20、40、80 μmol/L濃度的賴氨大黃酸，每個濃度設9個復孔，分別培養48 h，吸出上清液后，按照試劑盒的說明書進行操作。采用μQuant分光光度計檢測波長為450和630 nm的各孔吸光度值(A450和A630)。以(實驗孔A450-空白孔A450)/(LacZ孔A450-空白孔A450)作為標準化后的數據，采用SPSS11.0軟件包對3個孔的均值進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測HBV DNA及miRNA 將培養的HepG2.2.15細胞經20 μmol/L賴氨大黃酸處理48 h后，吸出的上清液，按照HBV DNA定量診斷試劑盒(PCR-Fluorescence Probing)說明書進行操作，數據的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。通過軟件可以計算出所有標準品和標本的閾值循環(Ct)，并且根據標準品Ct值繪制出標準曲線，由標準曲線計算出樣品的起始拷貝數Co=10(Ct-Intercept)/slope。同時，根據Takara公司SYBR PrimeScript?miRNA RT-PCR試劑盒說明書加入1 μg的總RNA及反轉錄反應所需試劑，反應條件為37 ℃ 60 min；85 ℃ 5 s。用反轉錄合成的cDNA作為模板進行RT-PCR檢測miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217的表達水平。

2 結 果

2.1 賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞增殖的影響 MTS法測定結果表明，5、10、20 μmol/L的賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞增殖沒有明顯的影響，當賴氨大黃酸濃度大于20 μmol/L時能抑制HepG2.2.15細胞增殖(P<0.05)，賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞增殖的抑制作用呈濃度和時間依賴性，見表1。

表1 賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞增殖的影響

注:與對照組培養24 h結果比較，*P<0.05；與對照組培養48 h結果比較，#P<0.05。

2.2 賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg表達及HBV復制的影響 選擇經MTS法測定，對HepG2.2.15細胞增殖沒有明顯影響的5、10、20 μmol/L濃度的賴氨大黃酸作用于HepG2.2.15細胞，采用ELISA法檢測HBsAg和HBeAg表達水平。加入不同濃度賴氨大黃酸的各實驗組分別與對照組比較，最后以對照組結果為“1”進行標準化。ELISA法檢測結果表明，5、10 μmol/L的賴氨大黃酸對HBsAg和HBeAg表達沒有明顯影響；20 μmol/L的賴氨大黃酸能抑制HBsAg和HBeAg表達，與對照組相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。采用RT-PCR檢測對照組和加入不同濃度賴氨大黃酸的各實驗組HBV DNA水平，最后的結果以對照組的值為“1”進行標準化，各實驗組分別與對照組比較，結果顯示20 μmol/L的賴氨大黃酸抑制了HBV復制，與對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg表達水平及HBV復制的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217、miR-370 ASO轉染對HepG2.2.15細胞增殖、HBsAg、HBeAg表達水平的影響 實驗篩選對HBsAg、HBeAg表達及HepG2.2.15細胞增殖有明顯影響的328種人類miRNA，實驗中每種轉染的miRNA ASO做3個復孔，重復檢測3次，實驗組分別與轉染LacZ基因的對照組進行對比，最后的結果以對照組的檢測值為“1”進行標準化。結果顯示，與轉染LacZ基因的對照組比較，在沒有對HepG2.2.15細胞的增殖產生明顯影響的情況下，對HBsAg產生有明顯影響的miRNA有miR-199a-3p、miR-196a、miR-210、miR-184、miR-217、miR-185、miR-370(P<0.05)，見表3。

表3 對細胞增殖、HBsAg和HBeAg產生影響的

轉染基因細胞增殖HBeAgHBsAgLacZ1.00±0.041.00±0.021.00±0.03miR-184ASO0.93±0.080.94±0.031.54±0.03*miR-185ASO0.95±0.020.95±0.031.58±0.03*miR-196aASO0.97±0.071.12±0.031.59±0.02*miR-199a-3pASO0.98±0.081.00±0.021.56±0.01*miR-210ASO0.98±0.030.98±0.021.28±0.03*miR-217ASO0.98±0.020.89±0.021.29±0.07*miR-370ASO1.00±0.030.89±0.030.63±0.12*

注：與轉染LacZ基因比較，*P<0.05。

2.4 賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞中miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217表達水平的影響 選擇20 μmol/L濃度的賴氨大黃酸作用于HepG2.2.15細胞，采用RT-PCR檢測HepG2.2.15細胞中miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184表達水平，加入20 μmol/L賴氨大黃酸的實驗組與未加賴氨大黃酸的對照組比較，最后的結果以對照組的檢測值為“1”進行標準化。結果顯示，20 μmol/L的賴氨大黃酸明顯促進了miR-210、miR-185、miR-199a-3p的表達，抑制了miR-370的表達，與對照組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 賴氨大黃酸對HepG2.2.15細胞中miRNA表達的影響

注:與對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

HBV是嗜肝DNA病毒，是引起病毒性肝炎的主要病原體之一。雖然現在有預防性疫苗，但是疫苗的推廣使用及免疫效果等方面尚存在許多問題[2]。乙型肝炎的治療至今尚無良策，因此深入研究HBV感染機制，尋找病毒與宿主細胞之間的相互調控和作用機制，將有利于幫助研究人員找到治療這種感染性疾病的有效方法。

中醫藥抗HBV的主要思路是通過扶正祛邪達到清除或抑制其復制的目的[3]。目前篩選抗HBV中藥主要有3條途徑：(1)利用中草藥直接作用于人血清來篩選。(2)利用體外細胞培養篩選抗HBV中草藥。(3)利用鴨乙型肝炎動物模型來篩選抗 HBV中草藥。

中藥對病毒性傳染病的作用是肯定的，但尚缺乏有說服力的實驗證據。故從細胞、分子、蛋白質水平進行機制研究和有效藥物的篩選，研究出有效的中藥顯得尤為重要。傳統中藥大黃中的一個重要蒽醌類化合物大黃酸具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤細胞增殖等。不同劑量的大黃酸具有不同的功效[4-5]。由于大黃酸水溶性差，生物利用度低，使其進一步應用受到很大限制。為了改善大黃酸的水溶性，由衛生部北京醫院/衛生部北京老年醫學研究所林雅軍博士合成了大黃酸的賴氨酸鹽(分子式C21H22N2O8，相對分子質量430)，并申請了國家專利。與大黃酸相比，賴氨大黃酸溶解度顯著提高至8 mg/mL，其中的賴氨酸鹽是人體8種必需氨基酸之一，安全無不良反應。因此，賴氨大黃酸比大黃酸更適合臨床研究與應用[6]。

近年發現的miRNA作為1種轉錄后基因調節機制，參與了生物體的生長、發育、衰老、死亡的調控過程，成為了病毒與宿主細胞相互作用過程中的一種重要的調控分子[7]。越來越多的研究證實病毒編碼的miRNA分子或細胞內源性的miRNA均參與了病毒感染宿主細胞及宿主細胞抗病毒的過程，發揮對病毒與宿主細胞相互作用的促進因子或抑制因子，在病毒的生命活動周期中具有重要作用[8-11]。目前已發現miR-32可以與泡沫病毒(PFV)mRNA的3′非翻譯區(UTR)不完全互補結合而抑制病毒轉錄本的翻譯，從而限制了病毒的增殖[12]。可見，宿主細胞的miRNA不僅可以作為1種抗病毒機制，而且可促進病毒的增殖，參與病毒的組織親嗜性。對這些細胞miRNA在病毒感染過程中的作用的深入理解，將有助于揭示病毒組織親嗜性和致病機制，從而為抗病毒藥物靶點的選擇和抗病毒新療法的開發奠定基礎。

本研究中，利用穩定整合HBV DNA的HepG2.2.15細胞(可以產生高水平的HBeAg和HBsAg)作為研究HBV復制和增殖的模型，用于研究賴氨大黃酸體內外對HBV復制的調控作用，結果顯示，在沒有對細胞增殖活性產生影響的情況下，賴氨大黃酸(20 μmol/L)抑制了HBsAg的產生和HBV的增殖。本研究通過轉染328種人類miRNA的ASO封閉宿主細胞的miRNA功能，通過初步篩選實驗，采用MTS法檢測細胞的增殖活性，ELISA法檢測HBeAg和HBsAg表達水平，RT-PCR檢測HBV DNA，初步得到了一些不影響細胞增殖但對病毒復制有影響的細胞miRNAs，包括miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184。在此基礎上，選擇20 μmol/L的賴氨大黃酸作用于HepG2.2.15細胞，采用RT-PCR檢測HepG2.2.15細胞中miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184表達水平，發現20 μmol/L的賴氨大黃酸明顯促進了miR-210、miR-185、miR-199a-3p的表達，而抑制了miR-370的表達。進一步研究這幾個miRNA抑制HBV增殖的機制，找到它們的靶基因，并將miRNA的功能與它們各自靶基因功能聯系起來，將有助于為抗HBV治療提供新途徑。

綜上所述，本研究通過分析賴氨大黃酸與miRNA在HBV感染中的作用，為理解賴氨大黃酸、細胞miRNA調控病毒增殖提供了新的理論依據，也為今后開發抗病毒藥物或治療手段提供了新的分子基礎或靶點。

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RHL inhibiting proliferation of HBV in HepG2.2.15 cells through regulating the miRNA expression level*

ZHANGRong-hua1,WANGMi-si1,WANGLin1,FENGXue-yan1,HAOXiao-fang1,ZHENYong-zhan1,LILin1，CHENJing1,ZHANGGuang-ling1,2△

(1.TeachingandResearchingSectionofPathogenicMicrobiologyandImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China;2.TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To study the effect and molecular mechanisms of rhein lysinate(RHL) on the proliferation of hepatitis B virus(HBV) and viral antigen expression to establish the preliminary experimental evidence for researching the anti-HBV mechanism of RHL.Methods HepG2.2.15 cells were divided into the experimental groups(adding 5,10,20,40,80 μmol/L RHL) and the control group without adding RHL.After culturing for 24,48 h,the supernatant was obtained.The cell proliferation activity was detected by the non-radioactive cell proliferation assay(MTS),the expression level of HBsAg and HBeAg were detected by adopting the ELISA method,the HBV DNA copy number and the expression levels of miR-210,miR-185,miR-199a-3p,miR-370,miR-196a,miR-184 and miR-217 were detected by real time quantitative PCR(RT PCT).HepG2.2.15 was transfected by miR-210,miR-185,miR-199a-3p,miR-370,miR-196a,miR-184 and miR-217ASO,the cell proliferation activity was detected by the MTS method,the expression levels of HBsAg and HBeAg were detected by rthe enzyme linked immunosorbent assay(ELISA),respectively.Results Without generating the effect on the cell proliferation activity,RHL inhibited the generation of HBsAg and the HBV proliferation.The expression level of miR-210,miR-185 and miR-199a-3p was increased by RHL(20 μmol/L) and the expression level of miR-370 was inhibited by RHL(20 μmol/L),the differences compared with the control group were statistically significant(P<0.05).Conclusion RHL is possible to suppress HBV proliferation and HBsAg generation by affecting the miRNA expression in HepG2.2.15 cells.

rhein lysinate; hepatitis B virus; hepatitis B surface antigen; miRNA

國家自然科學青年基金資助項目(81201281)；河北省自然科學基金資助項目(H2013209180、C2012401037、H2013209040)；河北省唐山市科技計劃資助項目(12140209A-4)；華北理工大學研究生創新項目(2015S16、2015S17)；國家級、省級大學生創新項目(201410081021)。

張榮花，女，在讀碩士，主要從事病毒相關腫瘤學研究。

△通訊作者，E-mail：zhguangling@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.19.003

A

1672-9455(2015)19-2817-03

2015-01-28

2015-04-15)