微小RNA在急性心肌梗死中調控作用的研究進展*

彭蘭芬，陳載鑫，張少豐，辛培建 綜述，朱振宇△> 審校

(1.廣東醫學院附屬厚街醫院檢驗醫學中心，廣東東莞 523945；2.中山大學臨床檢驗標準化研究中心，廣州 510080)

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·綜 述·

微小RNA在急性心肌梗死中調控作用的研究進展*

彭蘭芬1，陳載鑫1，張少豐1，辛培建2綜述，朱振宇2△> 審校

(1.廣東醫學院附屬厚街醫院檢驗醫學中心，廣東東莞 523945；2.中山大學臨床檢驗標準化研究中心，廣州 510080)

微小RNA； 急性心肌梗死； 生物標志物

急性心肌梗死(AMI)是冠心病的一種危重臨床類型，其進展迅速，后果嚴重。如果在數小時內得不到明確診斷及適當的治療，心肌就會缺血缺氧造成不可逆的壞死，因此，AMI的早期診斷至關重要。

微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中。它由DNA轉錄產生，但并不翻譯成蛋白質，而是在蛋白質合成中調節其他基因功能，因此miRNA是調控其他蛋白質編碼基因的基因[1]。miRNA在生物的生長、發育和疾病發生的病理生理機制中扮演著重要角色，許多疾病以一種或幾種miRNA表達異常為特征。確定組織或者血漿中表達量異常的miRNA種類，對于疾病的早期診斷和發展進程都有重要作用[2]。循環外周血液中心肌細胞來源的miRNAs在心血管系統疾病發生的生理和病理機制中都發揮非常重要的作用，其表達遠遠早于各種釋放到循環血液中的蛋白質如各種心肌生化標志物的出現，是心血管疾病新的標志物，多種心血管系統疾病的病理改變早期有miRNA分子的參與，包括AMI、心肌病、心律失常和動脈血管硬化等[3]。盡管miRNA 的功能尚待闡明，但通過對其表達譜的研究已經發現miRNA具有很強的細胞、組織或疾病特異性，這些特異表達的miRNA既是其功能研究的基礎，又是很好的疾病標志物[4]。

1 miRNA生物合成及功能

miRNA的合成從轉錄生成初級miRNA(pri-miRNA)開始，通過Drosha和Dicer等相關合成酶的加工，最終生成成熟的miRNA，成熟的miRNA和相關蛋白質形成RNA誘導沉默復合物(RISC，也稱miRISC)調控基因轉錄后的翻譯過程[5]。

成熟miRNA調控靶mRNA翻譯的機制主要有三種：(1)二者不完全互補，即二者不完全配對結合時，主要影響翻譯過程，而對mRNA的穩定性無任何影響。(2)二者完全互補，即二者完全配對結合后，類似siRNA與靶mRNA的結合，特異性的切割mRNA。(3)上述兩種模式均具備，當其與靶mRNA完全互補配對時，直接靶向切割mRNA，而不完全互補配對時起調節基因翻譯的作用。

上述miRNA調控mRNA表達的機制說明miRNA與靶mRNA不是一一對應的關系，一個miRNA可以調控不同的mRNA的表達，而多個miRNA可以調控同一個mRNA的表達。鑒于miRNA在生物體擔負著舉足輕重的作用，越來越多的實驗室開展了miRNA的相關研究。現在，對miRNA生物機制的研究和miRNA與疾病關系的研究已成為世界生物學的研究熱點之一。

2 miRNA在AMI中的調控作用

2.1 miRNA與動脈粥樣硬化病理進程相關 AMI最根本的原因是冠狀動脈粥樣硬化和在此基礎上形成冠狀動脈血栓所致。miRNA可以通過對內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和單核細胞等相關細胞功能和形態的調控，通過影響脂質代謝途徑、慢性炎性反應過程及對血小板的活化和聚集，參與冠狀動脈粥樣硬化的發病過程。最近Loyer等[6]在小鼠中的研究發現，動脈粥樣硬化進程與血管內血流切變力和氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxLDL)密切相關，提出miRNA-92a為動脈粥樣硬化相關miRNA，稱其為atheromiR。通過對小鼠動脈和人動脈粥樣硬化斑塊分析顯示，miRNA-92a作為動脈粥樣硬化的候選miRNA，在低切變力和oxLDL的共同作用下，可調節內皮細胞的活化并優先表達于低切變力處。miRNA-92a的這種表達方式與Kruppel樣轉錄因子(KLF)2、KLF4和細胞信號傳導抑制因子5相關，所以通過抑制其表達可防止內皮細胞功能紊亂和動脈粥樣硬化的發生。另有研究發現,miRNA-126參與調控內皮細胞的遷移、增殖及凋亡，敲除老鼠 miRNA-126的基因序列后，造成血管完整性的破壞及影響血管的形成；miRNA-21通過增加黏附分子作用于過氧化物酶增殖物激活受體α(PPAR-α),使PPAR-a表達減少，促進動脈粥樣硬化進展；miRNA-146a與動脈粥樣斑塊形成的病理過程及斑塊的穩定性相關[7-9]。

2.2 miRNA與心臟基因調控有關 miRNA的表達具有細胞和組織特異性，目前認為具肌肉和心臟組織特異性且在心肌細胞中表達豐富miRNA有五種，分別為miR-1、miR-133、miR-206、miR-208、miR-499。其中miR-1和miR-133具肌肉特異性并調節心臟的生長發育；miR-208和miR-499則具有心臟組織特異性并且在心肌中表達豐富。以上miRNA在AMI等心臟疾病的發病機制、診斷、預后和治療方面均具有重大意義[10]。現已有研究提示miR-1、miR-18b、miR-21、miR-133、miR-195、miR-208等參與控制或調節心肌肥大這一病理過程。miR-1、miR-133a、miR-208在AMI鼠動物模型或冠脈閉塞-局部缺血再灌注豬動物模型中均顯著升高，并在120 min內呈現高峰。而在經皮冠脈介入治療的STEMI患者循環血漿中均顯著升高，其中miR-208最初檢測不到，在癥狀出現后約1 h隨即升高，在12 h內呈現峰值。同時認為miR-1和miR-133與腎小球過濾率有負相關，表明其可能在一定時間段后被腎清除，并在尿液中檢測到，但未檢測到miR-208。miR-208與肌鈣蛋白T和射血分數相關[11-12]。

2009年美國新澤西州學者Dong等[13]在AMI大鼠模型中研究了miR-21的表達情況，認為miR-21在梗死區明顯下調，而在梗死區周邊卻上調；梗死區的過表達可明顯減少梗死面積；2011德國學者關于AMI患者外周血液中的全基因組miR表達分析的相關研究表明，miR-1291、miR-663b具有診斷AMI的高敏感度和特異度，采用20個miRNA譜，其診斷效能更佳(敏感度90%、特異度96%、準確度93%)，而miR-30c、miR-145表達水平與梗死范圍大小及心肌鈣蛋白T(cTnT)釋放相關，認為miR是潛在治療靶標[14]。

國內學者對心肌梗死相關性miRNA研究情況：2010年哈爾濱醫科大學研究人員對循環血液中的miR-1進行了研究，認為其可作為潛在的AMI標志物[15]；山東徐冬梅等[16]研究認為 miR-1與心肌缺血損傷有關；韋永強等[17]為觀察AMI患者miR-1表達情況和體外反搏治療(ECP)對其水平的影響，結果顯示miR-1可作為AMI患者發病和病情進展的一項新型標志物。ECP可使miR-1表達下調，患者心功能獲得改善。

2.3 參與心肌纖維化 心肌纖維化是由中度至重度的冠狀動脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續性和(或)反復加重的心肌缺血缺氧所產生的結果，是心臟重塑的另一重要病理改變。miR-29家族(miR-29a、miR-29b、miR-29c)與心肌纖維化相關[18]，能夠抑制心肌纖維化的發生。在心臟中miR-29主要表達于心肌成纖維細胞，許多細胞外基質相關的基因(如ELN、FBN1、COL1A1、COL1A2、COL3A1)是miR-29的靶基因。研究發現，發生心肌梗死后第3天miR-29下調與I型、III型膠原蛋白相關基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)表達上調有關，且在梗死邊緣區出現彈性蛋白表達增加[10]。miR 133 和miR 30c也與心肌纖維化有關。北京施冰等[19]研究了大鼠AMI模型miR-214的表達變化，認為miR-214可能參與調控了心肌梗死后心室重塑。

2.4 參與血管新成的miRNA miR-130a、miR-17～92簇和miR-378是促進血管生成的miRNA，而miR-221、miR-222則通過作用于其靶基因干細胞因子受體c-kit并間接調節內皮細胞一氧化氮酶(eNOs)的表達，進而抑制血管內皮細胞分化、增殖、血管生成，而miR-15b通過可能的靶基因血管內皮生長因子和血管生成素2(Ang2)來抑制新血管和生成[10]。miR-320的許多靶基因均與血管生成相關。miRNA-126在新血管形成中發揮了重要作用，血管內皮miRNA-126是缺血相關血管生成信號的重要潛在靶點和調節位點[9，20]。

2.5 miRNA與心肌細胞電生理調控 心臟的電生理活動由離子通道和膜蛋白控制，miRNA調節心臟傳導和心律失常。AMI后心律失常的發生率幾乎為100%，室性心律失常是心臟猝死的高風險因素，而心力衰竭則是心血管疾病病變的終末期。心衰患者發生房顫最為常見，是患者死亡的主要原因。目前關于探討離子通道等相關基因與miRNA的關系成為研究熱點[21]。研究較多的是miRNA-1、miRNA-328、miRNA-26和miRNA-499。miRNA-1具心肌特異性，在房顫患者組織樣品中表達減少86%，其作用靶點是心臟內向整流鉀通道電流和間隙連接蛋白基因；有趣的是，其在室性心律失常下表達水平卻增加。因此在心房與心室不同組織中其調控作用有待進一步深入研究；miRNA-26也可有效地抑制內向整流鉀通道電流減少心律失常的發生[22-23]。房顫患者中miRNA-328表達增強，其作用靶點是編碼L-型鈣通道的CACNA1C和CACNB1，此外miRNA-328水平的升高可減少鉀內流和縮短動作電位間期APD，導致心律失常發生的可能。另外，AF患者心房組織中miRNA-499上調，有利于AF電生理重構，其靶基因是編碼SK3(人類弱傳導鈣激活鉀通道蛋白hsKCa3)的KCNN3(Ca2+激活K+通道蛋白基因3)[24-25]。

3 miRNA的臨床應用

3.1 miRNA穩定性與檢測方法 由于難于獲取心臟組織，miRNA的檢測主要依賴于外周血液標本。miRNA在血漿、血清和尿液中的穩定性非常好。Mitchell等[26]和Tijsen等[27]發現血漿室溫放置24 h或反復凍融8次，或極端pH(pH=1和pH=13)處理3 h和DNA酶(DNase)處理3 h，對血漿中內源miRNA分子幾乎沒有影響。而其他大多數RNAs在這些條件下一般都會被降解。另外，Chen等[4]采用RT-PCR方法從肺癌A549細胞提取的RNA中隨機擴增出一些miRNA，RNase處理3 h后，仍可以檢測到半數以上的miRNA，而對照的大分子RNA(18S rRNA、28S rRNA、GAPDH、β-actin、U6)則被迅速降解，顯示了血漿、血清等體液中的miRNA 作為理想的疾病標志物所需的某些特征。血漿中RNA耐受RNase降解的可能機制：(1)RNA可能與DNA退火，使得它們既耐受DNase降解又能耐受RNase降解；(2)RNA可能被包入脂質或脂蛋白復合物內而受到保護；(3)RNA可能是通過化學修飾或者和蛋白結合而受到保護。

循環miRNA檢測通常包括：miRNA的提取,可用Trizol LS或離心柱法分離純化；反轉錄；熒光定量PCR。目前miRNA檢測的qRT-PCR方法主要是基于莖-環的RT-PCR方法和基于poly(A)加尾的RT-PCR方法。這兩種方法均可以采用Taqman探針或者SYBR熒光染料，前者特異性更高，后者通用性好。

3.2 miRNA臨床診斷 miRNA的表達具有組織特異性，臨床可通過測定miRNA水平來早期診斷或鑒別診斷疾病。血漿中miRNA水平對心臟疾病的診斷已多有報道[10-15]。Corsten等[28]分別在AMI、病毒性心肌炎、擴張型心肌病和急性心力衰竭患者中進行了心臟相關miR(miR1、miR133a、miR208b、miR499)，纖維化相關miR(miR21、miR29b)和炎性相關miR(miR146、miR155、miR223)的研究，發現相對于健康對照組來說，AMI患者miR208b和miR499分別呈1 600倍和100倍升高，并與肌鈣蛋白T(cTnT)相關，說明其從受損心肌細胞釋放；在病毒性心肌炎中二者分別呈30倍和6倍升高；在心衰患者中則呈現2倍左右升高；在擴張性心肌病中未發現變化。同時炎癥相關miRNA并未發現明顯升高。

Tijsen等[27]證實了血漿miRNA-423-5p的水平可作為心力衰竭的又一項診斷指標，血漿中的miRNA可評估心臟疾病的嚴重程度和預后。比如，血漿miRNA-30c和血漿miRNA-145與cTnT水平顯著相關，可用來反映梗死面積，繼而判斷心肌梗死嚴重程度和預后[29-30]。

3.3 miRNA臨床治療 miRNA在心血管疾病的病理生理學的作用普遍存在，不論是上調或下調可作為介入治療的靶點。目前在治療上的方法主要有兩大類：一是增強miRNA表達方面的功能獲得性研究，如設計合適的病毒載體，最為有用的是腺相關病毒(AAVs)，其方法是通過導入感興趣的miRNA片段到載體中，AAVs特定的血清型與心肌細胞高度親和并具低免疫原性，使得它們適于將核酸傳遞給心肌細胞達治療目的。二是miRNA功能抑制性方法研究，利用miRNA反義寡核苷酸如2-O-甲基修飾的寡核苷酸，通常將其命名為miRNA拮抗劑antagmomir，結構上與miRNA互補結合抑制其功能。同樣作用的還有鎖核苷酸(LNA)和miRNA“海綿”。雖然從理論上來說，上述方法可直接調整miRNA水平進而影響其功能，但miRNA與靶mRNA不是一一對應的關系，一個miRNA可以調控不同的mRNA的表達，而多個miRNA可以調控同一個mRNA的表達。如上調miRNA-133可改善心肌肥大，但另一方面卻容易導致心律失常。如何使miRNA治療方法最優化服務臨床，還任重道遠[31]。

4 小 結

miRNA是近5年來生命科學和醫學界的明星分子，其作為新的疾病診斷標志物，非常值得關注與期待。許多疾病以一種或多種miRNA表達異常為特征，確定組織或者血漿中表達量異常的miRNA種類，對于疾病的早期診斷和鑒別診斷都有重要作用。近年來對 miRNA 的研究已取得重大進展，越來越多的 miRNA被陸續發現，生物學功能也逐漸得到闡明，但是 miRNA在心血管疾病中的功能及其作用機制仍有待探討，在疾病進程中循環miRNA譜發生改變的機制目前仍不十分明確，因此探求在特定組織或細胞中富集表達的miRNA，對于尋求組織損傷性疾病的血清miRNA標志物，探討miRNA在心血管疾病中的調節作用及其機制及基因治療方面具有積極意義。

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廣東省東莞市科技局重點課題資助項目(2012105102030)。

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