高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定馬鞭草中5種糖苷類成分的含量

王 華，任 非，段坤峰，陳學(xué)軍，袁志芳

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定馬鞭草中5種糖苷類成分的含量

王 華1，任 非2，段坤峰1，陳學(xué)軍1，袁志芳3

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法同時測定馬鞭草中桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的含量。方法 色譜柱采用Waters SunfireTMC18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水(25∶75→40∶60)，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，進樣量5 μL，柱溫30 ℃；采用電噴霧離子源(ESI)，以多反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM)進行定量分析。桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷在正離子電離模式下定量分析離子對分別為m/z 167.2→m/z 149.1、m/z 243.2→m/z 225.2、m/z 227.2→m/z 195.2、m/z 195.2→m/z 177.2。毛蕊花糖苷在負離子電離模式下定量分析離子對為m/z 461.3→m/z 161.0。結(jié)果 桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷五種組分在120～1 200,10 000～100 000,5 000～50 000,1.2～12,510～5 100 μg/L的濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為101.2%，98.63%，99.45%，101.6%，100.3%。結(jié)論 本法操作簡便、準確、具有良好的重現(xiàn)性, 為馬鞭草藥材的合理應(yīng)用及質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；桃葉珊瑚苷；戟葉馬鞭草苷；馬鞭草苷；龍膽苦苷；毛蕊花糖苷；馬鞭草

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草的干燥地上部分，收載于中國藥典2010版一部。具有活血散瘀、截瘧、解毒、利水消腫等功效[1]。藥典收載的馬鞭草是利用其脂溶性成分熊果酸作為鑒別和含量測定指標的，而馬鞭草基本上采用水提和醇提工藝。因此，研究馬鞭草極性成分能夠更好地監(jiān)控藥材的質(zhì)量。另外，中藥材的定量方法多是該藥材中具有一定藥理活性的有效成分，本實驗小組先前對馬鞭草不同提取物的鎮(zhèn)咳、抗炎和祛痰作用進行了系統(tǒng)的藥效學(xué)研究[2]，結(jié)果表明馬鞭草醇提物的正丁醇部分和醋酸乙酯部分為鎮(zhèn)咳作用的有效部位，此后又對這兩部分的化學(xué)成分進行了研究[3]，發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷含量最高，是馬鞭草的主要活性成分，適合作為馬鞭草藥材的指標性成分。因此，同時檢測馬鞭草中這5個糖苷類極性成分的含量對于馬鞭草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制都具有重要意義。本實驗小組采用HPLC-MS/MS法測定取得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材 料

1.1儀器 Applied Biosystems 3200 QTRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，配有三重四級桿帶線性離子阱和電噴霧離子源ESI，analyst 1.4.2 software工作站)；Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，包含G1322A型脫氣機，G1311A型四元泵，G1329A型自動進樣器，G1316A型柱溫箱，G1314B型紫外檢測器)。

1.2試藥 桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷、龍膽苦苷對照品(批號分別為111761-200601，111530-200706，110770-200611)均購自中國食品藥品檢定研究院；馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷為自制產(chǎn)品(經(jīng)柱色譜分離，且經(jīng)IR、MS、1H-NMR、13C-NMR確定結(jié)構(gòu)[4-5]，質(zhì)量分數(shù)大于98.5%。)；馬鞭草藥材購自石家莊樂仁堂藥店及不同產(chǎn)地的藥業(yè)公司，經(jīng)河北藥科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室聶鳳褆教授鑒定。馬鞭草藥材經(jīng)40 ℃干燥后，粉碎過24目篩，備用。甲醇、甲酸均為色譜純(美國迪馬公司)，水為注射用水，其余試劑均為分析純試劑。

2 方 法

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞100 mL錐形瓶中，加入20 mL 80%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，稱質(zhì)量，用80%甲醇補充減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用，即得。

2.1.2對照品溶液 分別精密稱取5種糖苷類化合物對照品適量，加80%甲醇溶解并稀釋制成含桃葉珊瑚苷1.2 mg/L、戟葉馬鞭草苷100.0 mg/L、馬鞭草苷50.0 mg/L、龍膽苦苷12 μg/L、毛蕊花糖苷5.1 mg/L的混合溶液，即得。

2.2色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1色譜條件 色譜柱： Waters SunfireTMC18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水(25∶75→40∶60,0→6 min)，梯度洗脫；流速0.8 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

2.2.2質(zhì)譜條件 采用正負離子電噴霧離子源(ESI)，選取靈敏度好的離子模式。采用多反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM)進行質(zhì)譜掃描定量分析。通過離子去簇電位(DP)、入口電位(EP)和碰撞能量電位(CE)的優(yōu)化，選取響應(yīng)值高的質(zhì)譜條件。正離子電離模式：離子噴霧電壓5 500 V，離子源溫度650 ℃，離子源氣體1(GS1，N2)壓力400 kPa，離子源氣體2(GS2，N2)壓力450 kPa，氣簾氣體(CUR，N2)壓力137 kPa，碰撞氣(CAD)Medium。負離子電離模式：離子噴霧電壓-4 500 V，離子源溫度650 ℃，離子源氣體1(GS1，N2)壓力400 kPa，離子源氣體2(GS2，N2)壓力450 kPa，氣簾氣體(CUR，N2)壓力137 kPa，碰撞氣(CAD)Medium。

3 結(jié) 果

離子檢測的篩選參數(shù)見表1。對照品溶液的離子掃描質(zhì)譜圖見圖1～5。

4 方法學(xué)考察

表1 馬鞭草離子檢測的篩選

4.1標準曲線的制備 精密吸取“2.1.2”項下的對照品溶液1.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按選定的色譜條件測定峰面積。以對照品質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標，相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，線性關(guān)系良好。見表2。

4.2定量限 分別精密吸取各對照品儲備液適量，加甲醇溶解，并逐漸稀釋至信噪比S/N≥10時，即為定量限。見表2。

4.3重復(fù)性試驗 取同一批藥材粉末，精密稱取6份，按“2.1.1”項下方法分別平行制備6份供試品溶液，按選定的色譜條件測定。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.3%，1.6%，1.8%， 1.7%，1.9%，說明重復(fù)性良好。

4.4精密度試驗 取馬鞭草藥材粉末，按“2.1.1”項下方法制備1份供試品溶液，按選定的色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣6次。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.2%，1.5%，1.3%， 1.9%，1.8%，說明精密度良好。

圖1 桃葉珊瑚苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖2 戟葉馬鞭草苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖3 馬鞭草苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖4 龍膽苦苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖5 毛蕊花糖苷離子掃描質(zhì)譜圖

表2 5種糖苷類化合物的標準曲線

4.5穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品試液，在室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h測定5種糖苷類化合物的質(zhì)量濃度。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷質(zhì)量變化的RSD分別為1.9%，1.3%，1.7%，1.8%，1.2%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.6回收率試驗 精密稱取6份已知5種糖苷類化合物質(zhì)量濃度的藥材粉末0.25 g，依次加入按“2.1.2”項下方法制備的混合對照品溶液17 mL及80%甲醇3 mL，按“2.1.1”項下方法操作，按選定的色譜條件測定。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的平均回收率分別為101.2%，98.63%，99.45%，101.6%，100.3%，RSD分別為1.3%，1.5%，0.8%，1.7%，1.2%(n=6)。

5 樣品測定

取不同來源馬鞭草藥材粉末各0.50 g，精密稱定，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按選定的色譜條件測定，以外標法計算桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的質(zhì)量。見表3。

表3 不同來源馬鞭草藥材中5種糖苷類化合物的含量(n=3，mg/g)

6 討 論

馬鞭草藥源豐富、廉價易得，具有多種藥理活性，治療范圍廣泛，尤其在神經(jīng)保護方面，其作用機制更是多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑的，對防治老年癡呆、帕金森氏病等神經(jīng)退行性病變具有很好的療效。另外，在鎮(zhèn)咳和抗動脈粥樣硬化方面也有確切的療效。近幾年來，本實驗小組一直致力于馬鞭草的研究，先前在應(yīng)用HPLC法測定馬鞭草中戟葉馬鞭草苷和馬鞭草苷[6]的過程中，也嘗試過HPLC法測定5種糖苷的含量，但未獲成功，可能是由于儀器的靈敏度限制所致。

本實驗選定用20倍80%甲醇超聲處理45 min來制備樣品，是因為先前對不同濃度(20%，40%，60%，80%及100%)甲醇的提取率、不同超聲提取時間(15，30，45，60 min)以及超聲處理和回流提取兩種方式等進行了比較，從而采取的最佳方法。

樣品的檢測結(jié)果表明，各產(chǎn)地藥材5種糖苷的含量差異較大，本實驗首次建立同時測定馬鞭草中5種糖苷含量的方法，為科學(xué)評價與有效控制馬鞭草藥材質(zhì)量提供了新手段。該方法操作簡便、準確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為馬鞭草藥材的鑒別和質(zhì)量控制方法。

[1] 中國藥典委員會. 中國藥典(一部)[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：49

[2] 任非，袁志芳，段坤峰，等. 馬鞭草提取物的鎮(zhèn)咳、抗炎和祛痰作用研究[J]. 中國藥房，2013，24(31)： 2887-2890

[3] 任非，段坤峰，付穎，等. 馬鞭草鎮(zhèn)咳有效部位化學(xué)成分的研究[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2013，33(6)：445-449

[4] Teborg D，Junior P. Iridoid glucosides from penstemon nitidus[J]. Planta Med，1991，57(2)：184-186

[5] 張濤，阮金蘭，呂子敏. 馬鞭草環(huán)烯醚萜苷類成分的研究[J]. 中草藥，2000，31(10)：721-723

[6] 袁志芳，段坤峰，張?zhí)m桐，等. HPLC法同時測定馬鞭草中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷[J]. 中草藥，2009，40(5)：818-820

Simultaneous determination of five glycosides in Verbena Officinalis L. by HPLC-MS/MS

WANG Hua1, REN Fei2, DUAN Kunfeng1, CHEN Xuejun1, YUAN Zhifang3

(1.The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China; 2.The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 3.Pharmacy School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China)

Objective It is to establish a HPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and verbascoside in Verbena officinalis L. Methods All separations were carried out on a Waters SunfireTM C18 column (4.6mm×150mm, 5μm) with the mixture of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid (25∶75→40∶60) as mobile phase by gradient elution at the flow rate of 0.8 mL/min and injection volume was 5 μL. The temperature of column was 30℃. Detection was performed with multiple reactions monitoring (MRM) by using electrospray ionization (ESI) source. The production transitions were monitored at m/z 167.2→m/z 149.1, m/z 243.2→m/z 225.2, m/z 227.2→m/z 195.2, m/z 195.2→m/z 177.2 (ESI+ mode) for aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and m/z 461.3→m/z 161.0 (ESI-mode) for verbascoside. Results The linearity was good for aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and verbascoside in the range of 120-1 200, 10 000-100 000, 5 000-50 000, 1.2-12, 510-5 100 ng/mL. The average recoveries were 101.2%, 98.63%, 99.45%, 101.6% and 100.3% respectively. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible. It can set the basis for reasonable application and quality control for Verbena Officinalis L.

HPLC-MS/MS; aucubin; hastatoside; verbenalin; gentiopicroside; verbascoside; Verbena Officinalis L.

王華，女，主管藥師，研究方向為藥物質(zhì)量控制。

任非，副主任藥師，E-mail:renfei680811@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.03.003

R969.4

A

1008-8849(2015)03-0235-04

2013-10-30